安顫靈對(duì)帕金森病模型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與泛素—蛋白酶體系統(tǒng)的影響.pdf

1、目的：
　　 帕金森病(Parkinson disease,PD)是漸行性神經(jīng)退行性疾病,表現(xiàn)為黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性死亡,神經(jīng)元胞漿內(nèi)包涵體Lewy小體增多。PD的病因至今仍未完全明確,但公認(rèn)的機(jī)制有興奮性毒性和能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激、線粒體活性下降等功能紊亂。環(huán)境因素比如殺蟲(chóng)劑和其他因素也可以誘發(fā)散發(fā)性PD,而散發(fā)性PD占全部病例了90％以上。最近研究表明,PD疾病的發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和泛素一蛋白酶體系統(tǒng)有關(guān)。本課

2、題結(jié)合國(guó)際帕金森病研究的最新進(jìn)展和動(dòng)態(tài),采用腹腔注射MPTP誘導(dǎo)模擬人的PD慢性病程的動(dòng)物模型,研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與帕金森病發(fā)病的關(guān)系;同時(shí)進(jìn)行天然中藥新藥安顫靈的藥效學(xué)作用機(jī)理研究,為其進(jìn)一步中藥新藥開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　 (1)建立PD模型及實(shí)驗(yàn)分組:
　　 選取健康雄性C57BL/5J小鼠60只(9周齡),隨機(jī)分成5組,分別為PD模型組12只,予

3、小鼠腹腔體內(nèi)注射MPTP(30mg/kg.d),同時(shí)蒸溜水灌胃與安顫靈組等體積。正常對(duì)照組12只,蒸溜水灌胃與模型組相同,腹腔注射改為相同體積的生理鹽水(30mg/kg.d)。安顫靈組(分高、中、低劑量組),每組各12只,該組在模型組基礎(chǔ)上將灌胃的蒸溜水改為以上不同劑量的中藥煎液。
　　 (2)動(dòng)物行為學(xué)觀察:
　　 注射后7d、14d和21d按0.25mg/kg腹腔注射阿撲嗎啡,觀察旋轉(zhuǎn)行為的變化,共記錄30min取平

4、均值。同時(shí)注意觀察小鼠震顫、活動(dòng)遲緩、抓握、嗅探等異常行為。
　　 (3)黑質(zhì)區(qū)TH、GFAP、OX-42免疫組化檢測(cè):
　　 注射后第21天,在2.5%戊巴比妥鈉麻醉下,從左心室插管灌注4%多聚甲醛,之后斷頭取腦,經(jīng)系列生化固定后。自近黑質(zhì)部位起連續(xù)冠狀切片,挑取對(duì)稱的黑質(zhì)區(qū)切片。行TH、GFAP、OX-42免疫組織化學(xué)染色,觀察中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)及小膠質(zhì)細(xì)胞(OX-42)的

5、變化,以了解DA能神經(jīng)元損毀情況以及是否選擇性地?fù)p毀多巴胺能神經(jīng)元以及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。切片再經(jīng)系列生化免疫標(biāo)記,置顯微鏡觀察,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　 (4)a-synuelein、Parkin和泛素(ubiquitin)的免疫組化檢測(cè):
　　 通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法觀察DA能神經(jīng)元lewy小體的主要成分a-共核蛋白(a-synue lein)、Parkin和泛素(ubiquitin)的表達(dá)。切片經(jīng)系列生化免疫標(biāo)記后,顯

6、微鏡觀察,顯微圖象分析檢測(cè)。模型組、正常組、安顫靈組處理時(shí)間和劑量完全相同。
　　 (5)RT-PCR檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)組織Caspase-12 mRNA的表達(dá):
　　 GenBank檢索小鼠Caspase-12序列,自行設(shè)計(jì)引物,由上海Sangon公司合成。Caspase-12引物(506bp)上游:5'-AGGCAACTCTCATGCAGTTC-3'(1319-1338bp),下游:5'-AACCATGTATGCCAGAG

7、AC C-3'(1847-1866 bp)。取總RNA4 ul,加入01ig(dT)1 ul,65℃15 min,立即置冰上;加人10XRT緩沖液2μl,dNTP2ul,25 mmol/L MgC122μl,RNA酶抑制劑1μl,A-MV1μl,加DEPC處理水至總體積20μl,42℃60 min逆轉(zhuǎn)錄;取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA4μl,加入10%PCR緩沖液5μl,dNTP1μl,Caspase-12上游、下游引物各2μl(20 pm01)

8、,Taq酶(5 U/μl)0.25μl,25 mmol/L MgC123μl,加無(wú)菌雙蒸水至總體積50μl。PCR條件:94℃5 min,94℃40 s,55℃40 s,72℃90 s,35個(gè)循環(huán);72℃10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl行瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描caspase-12灰度值.。比較各組黑質(zhì)區(qū)組織caspase-12 mRNA的表達(dá)。(6)Western blot檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)組織caspase-12,CHOP、

9、Bip/GRP78蛋白的表達(dá):
　　 50 mg小鼠黑質(zhì)組織用1%TritonX-100加蛋白酶抑制劑裂解,用牛血清白蛋白方法檢測(cè)蛋白含量。每一樣品取總蛋白30 ug上樣,用12%不連續(xù)聚丙烯酞胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜;5%脫脂奶粉封閉2h;加進(jìn)入Caspase-12、CHOP、Bip/GRP78第一抗體輕搖2h后4℃過(guò)夜;Tris磷酸鹽緩沖液洗膜15 min,共3次;加人辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體37℃1 h,Tri

10、s磷酸鹽緩沖液洗膜15 min,共3次?；瘜W(xué)發(fā)光試劑作用后x膠片曝光,經(jīng)顯影、定影等處理后觀察結(jié)果。用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像,對(duì)其灰度分析,比較各組黑質(zhì)區(qū)組織Caspasc-12,Bip/GRP78蛋白的表達(dá)。(7)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用均值(-x)±標(biāo)準(zhǔn)差(s),采用SAS軟件包行單因素方差分析檢驗(yàn),以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 2.離體實(shí)驗(yàn):安顫靈對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
　　 (1)

11、細(xì)胞株及培養(yǎng)體系:
　　 PC12細(xì)胞是小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株,由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。細(xì)胞接種在預(yù)先鋪過(guò)鼠尾膠的培養(yǎng)皿中,用含有10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco BRL公司),同時(shí)加入2mmol/L谷氨酰胺、100u/ml鏈霉素和100u/ml青霉素,在溫度37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天傳代細(xì)胞1次,實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,且存活細(xì)胞百分率均在95%

12、以上(臺(tái)盼蘭拒染法)。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)分組和處理:
　　 在24孔培養(yǎng)板上,按每孔1.25×105個(gè)細(xì)胞的濃度加入PC12,在DMEM中培養(yǎng)4h后,加入高、中、底不同濃度的安顫靈含藥血清(50,100,200ug/ml)預(yù)處理3d,然后將細(xì)胞暴露與200mMH2O2中。經(jīng)12h共同培養(yǎng)后,測(cè)定細(xì)胞的凋亡/死亡和存活情況。設(shè)正常和模型對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 (3)PC12細(xì)胞DNA倍體的分析:
　　

13、在100μl樣本液中加人含50 mg/L碘化丙啶(美國(guó)BD公司)和50 mg/L核糖核酸酶A(上海生工生物工程公司)的染液500μl,避光37℃孵育30min,流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)進(jìn)行亞二倍體峰(subGl)的百分比分析。每份標(biāo)本利用cellQuestTM軟件分析10000個(gè)細(xì)胞,結(jié)果用百分比表示。
　　 (4)凋亡細(xì)胞染色和熒光觀察:
　　 棄去介質(zhì)和處理因素,用1×D-PBS輕輕清洗細(xì)胞一次。直接在細(xì)胞上添加適當(dāng)量(約

14、在24孔培養(yǎng)板上按50uL/孔,在12孔培養(yǎng)板上按100uL/孔或6孔培養(yǎng)板上按150uL/孔)的聯(lián)合染液(2mM calcein AM和4mM EthidiumHomodimer-1),在室溫下孵育30分鐘。標(biāo)記的存活和死亡細(xì)胞用熒光顯微系統(tǒng)(Zeiss Axiovert135M,Mercury Lamp,Carl Zeis HBO100W/Z),以485nm和590nm立即觀察和拍照。
　　 結(jié)果：
　　 1.動(dòng)物實(shí)

15、驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.1造模及行為學(xué)結(jié)果:腹腔注射MPTP后,PD模型組小鼠于第1次注藥后10-20 min均出現(xiàn)不同程度的震顫、豎毛、翹尾,上述癥狀持續(xù)4-5h后逐漸減輕,但仍有活動(dòng)減少,動(dòng)作遲緩等變化。治療前模型組和安顫靈組組間的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。治療后,實(shí)驗(yàn)第7天、第14天和第21天安顫靈組小鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)逐漸減少,分別與模型組相比,差異顯著(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。懸掛行為結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)

16、前1天(即首次注射MPTP前1天)觀察小鼠懸掛行為,模型組、安顫靈組小鼠評(píng)分分別與對(duì)照組相比,無(wú)差異(P＞O.05、P＞0.05);實(shí)驗(yàn)第7天、第14天和第21天觀察模型組小鼠懸掛行為,其評(píng)分明顯降低,分別與對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.01、P＜0.05);實(shí)驗(yàn)第14天和第21天安顫靈組小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分明顯升高,分別與模型組相比,差異顯著(P＜0.01、P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)前1天觀察小鼠爬桿行為,模型組、安顫靈組小鼠評(píng)分分別與對(duì)照組相

17、比,無(wú)差異(P＞0.05、P＞0.05)。注射MPTP第7天、第14天和第21天觀察模型組小鼠爬桿行為,其評(píng)分明顯降低,分別與對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.01、P＜0.05、),提示造模成功。實(shí)驗(yàn)第14天和第21天安顫靈組評(píng)分明顯升高,分別與模型組相比,差異顯著(P＜0.05、P＜0.05)。
　　 1.2.免疫組化、RT-PCR、Westernblot檢測(cè)結(jié)果:1.2.1免疫組化結(jié)果:PD模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH表達(dá)顯著降低(P

18、＜0.01),GFAP、OX-42表達(dá)增多。經(jīng)安顫靈灌胃處理的各組小鼠TH較模型組增多(P＜0.01),而GFAP、OX-42陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化。與模型組相比,中藥安顫靈組a-synuclein、Parkin、ubiquitin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均減少(P＜0.01)。1.2.2 RT-PCR結(jié)果提示,腹腔注射MPTP可誘導(dǎo)小鼠腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),而安顫靈對(duì)這一應(yīng)激反應(yīng)有一定的緩解作用。1.2.3.Wes tern blot檢測(cè)結(jié)

19、果顯示:模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)caspase-12、CHOP蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著上調(diào)(P＜0.01),提示黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)提高。安顫靈組caspase-12、CHOP蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低(P＜0.05)。模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)組織GRP78/Bip蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組上調(diào),安顫靈組GRP78/Bip蛋白的表達(dá)較模型組進(jìn)一步上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2.離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 實(shí)驗(yàn)光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組

20、PC12細(xì)胞排列整齊,貼壁生長(zhǎng)旺盛,形態(tài)規(guī)則,呈長(zhǎng)梭形或長(zhǎng)棱形,有長(zhǎng)短不等的類(lèi)似神經(jīng)軸突的偽足,交織成網(wǎng)狀。H2O2損傷后的模型組細(xì)胞,排列紊亂,貼壁不牢,偽足縮短火消失,大量細(xì)胞懸浮,碎裂,死亡。安顫靈含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞變化較模型組明顯減弱。細(xì)胞排列尚整齊,懸浮細(xì)胞較少,可見(jiàn)明顯偽足。與大、小劑量組相比,中劑量組細(xì)胞的存活率顯著升高(P＜0.01);與正常組相比,模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加(P＜0.01),a-synuclein、陽(yáng)性細(xì)

21、胞數(shù)亦均增多,而TH陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少;與H2O2組相比,安顫靈組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低,a-synuclein陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均減少,TH陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加(P＜0.01)。H2O2模型組PC12細(xì)胞與正常對(duì)照組相比細(xì)胞周期明顯左移。在細(xì)胞G1/G0期前有明顯的亞二倍體峰(subG1/G0),處于此期的細(xì)胞比率為(94.50±21.3)%,而正常對(duì)照組處于此期的細(xì)胞比率為(1.36±2.0)%。而且H2O2模型組G1/G0期及所占的比率明顯低于正

22、常對(duì)照組,G2期及M期的細(xì)胞所占的比例也減少,在細(xì)胞周期圖中代表這兩期的峰幾乎不可見(jiàn)。而同時(shí)給予不同濃度安顫靈含藥血清(2.5%、5%、10%)孵育后,Pcl2細(xì)胞subG1/G0百分比分別為(82.90±12.6)%、(69.34±15.7)%、(51.63±6.8)%。
　　 結(jié)論：
　　 中藥安顫靈小鼠行為學(xué)表明,采用MPTP注射法,造模成功;安顫靈能提高肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力,對(duì)MPTP誘導(dǎo)所致的PD模型小鼠PD運(yùn)動(dòng)體

23、征具有明顯的改善作用。ESR和UPS可能是PD多巴胺能神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵因素,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期調(diào)節(jié)過(guò)程就存有泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)異常蛋白的降解活動(dòng)。ERS和UPS有相互促進(jìn)作用,以達(dá)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡,保證內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。中藥安顫靈就是通過(guò)黑質(zhì)區(qū)組織Caspase-12 mRNA的表達(dá)和Caspase-12,CHOP、Bip/GRP78蛋白的表達(dá)靶點(diǎn)的干預(yù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ESR)影響和改善,減少細(xì)胞毒性蛋白的合成。通過(guò)

24、a-synuelein、和泛素(ubiquitin)蛋白的表達(dá)靶點(diǎn)的干預(yù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)UPS的影響和改善,提高發(fā)現(xiàn)和破壞這些裝配和折疊錯(cuò)誤的蛋白的能力,使它們及時(shí)降解,消除細(xì)胞毒性蛋白,達(dá)到改善保護(hù)黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元神經(jīng)細(xì)胞,減少細(xì)胞凋亡。同時(shí),對(duì)H202誘導(dǎo)的神經(jīng)元ERS與凋亡反應(yīng)具有顯著地拮抗作用,從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。提示,H2O2能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而安顫靈可抑制這一細(xì)胞凋亡過(guò)程。腹腔注射MPTP可誘導(dǎo)C57小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的內(nèi)ESR,