靶向性熱療-基因聯(lián)合治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究.pdf

1、研究目的：
　　采用種子生長法制備穩(wěn)定、均一的金納米棒溶液(GNRs)，用 PSA和BPVCAM-1對(duì)其進(jìn)行表面修飾，同時(shí)負(fù)載核酸類藥物 NF-κB-decoy ODNs，考察BPVCAM-1靶向的金納米棒熱療聯(lián)合基因治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)外效果。
　　研究方法：
　　(1)采用種子生長法制備金納米棒，三步離心的方法分離純化。紫外分光光度計(jì)(UV)掃描 GNRs的紫外特征吸收峰；電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（ICP-AE

2、S）測定GNRs的濃度；激光納米粒度分析儀測定GNRs的粒徑（Size）和電位(Zeta)；透射電子顯微鏡(TEM)觀察GNRs的形貌。
　　(2)金納米棒表面帶有正電荷，在靜電吸附作用下負(fù)載帶有負(fù)電荷的基因藥物NF-κB-decoy ODNs和安全的親水性多糖聚唾液酸（PSA）；在金-硫鍵的作用下將具有靶向作用的血管內(nèi)皮粘附因子-1（BPVCAM-1）的親和多肽修飾于金納米棒的表面，構(gòu)建出 PSA&BPVCAM-1修飾的 GNR

3、s-ODNs的納米給藥系統(tǒng)。二喹啉甲酸法（BCA）測定靶頭VCAM-1親和多肽的載體結(jié)合率；紅外光譜儀（FTIR）對(duì)納米載體進(jìn)行定性表征；用瓊脂糖凝膠電泳儀對(duì)GNRs、ODN、PSA、BPVCAM-1之間用量的摩爾比例進(jìn)行確定。
　　(3) CCK-8比色法考察各載體材料和給藥系統(tǒng)對(duì)Ges-1細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的抑制率；流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞攝取進(jìn)行定量分析；熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞攝取進(jìn)行定性分析；采

4、用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6細(xì)胞炎癥因子含量；采用完全弗氏佐劑（10 mg/ml）尾根部皮下注射小鼠建立AIA炎癥模型；采用活體成像儀考察載體在小鼠的體內(nèi)分布情況；采用病理組織切片考察GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1在體內(nèi)炎癥部位的抗炎作用。
　　研究結(jié)果：本課題制備的GNRs紫外特征吸收峰分別為520nm和806nm，長徑比大致為4；粒徑Size和電位Zeta分別為39.5±2.03nm和23.0±1.3

5、6mV；測定的GNRs濃度為1.76nM，透射電子顯微鏡呈現(xiàn)GNRs為圓柱形，且形狀大小均一。經(jīng)過對(duì)GNRs修飾成功制備了 GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1納米給藥系統(tǒng)，并對(duì)其進(jìn)行一系列表征：粒徑大小為47.5±5.21nm，電位-23.5±1.52mV，物質(zhì)的量關(guān)系為GNRs：ODN：PSA：VCAM-1=0.125 nM：150 nM：5μM：3μM，紫外吸收光譜未發(fā)生明顯變化，透射電子顯微鏡觀察到其表面有一層修飾物，能長

6、期保存；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明本納米給藥系統(tǒng)無細(xì)胞毒性，并能夠快速被RAW264.7細(xì)胞和 HUVEC細(xì)胞攝?。?HUVEC細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中， GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1+Laser組與各實(shí)驗(yàn)組相比，能更好地抑制細(xì)胞遷移；體內(nèi)外抗炎實(shí)驗(yàn)中，GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1+Laser組與Untreated組及其他實(shí)驗(yàn)組相比，有明顯的抗炎優(yōu)勢；組織切片實(shí)驗(yàn)表明， GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1+Laser組滑