微型化雙光子顯微鏡及自由活動小鼠神經(jīng)成像.pdf

1、課題研究背景：
　　大腦的重要功能之一是對生物體的行為活動進行調(diào)控，而反過來，生物體的行為活動也直接反應大腦的工作狀態(tài)。為了了解大腦，研究者不僅要求在活體狀態(tài)下對神經(jīng)元進行高分辨率觀測，而且也希望生物體在被觀測的階段里，能夠進行正常的行為活動。所以，在成像技術不斷地提高分辨率和速度等性能的同時，科學家們也在積極開改進和革這些成像技術手段，使其進行成像時盡可能小的限制被觀測對象的行為活動，以求獲得最接近生理狀態(tài)下的大腦活動的信息。<

2、br>　　近年來微型雙光子顯微鏡的發(fā)展為在被研究動物自由活動下直接觀察大腦結構和活動提供了工具。然而，若要研制出具有實用價值的微型雙光子顯微鏡面臨諸多挑戰(zhàn)，其原因在于雙光子成像技術本身有著苛刻的條件要求：
　　首先，與單光子熒光效應相比，雙光子熒光效應的發(fā)生概率極小，需要極高峰值功率的飛秒激光作為光源才能得到足有生物成像所需的熒光信號；其次，飛秒激光的傳輸是一個復雜的，非線性光學效應主導的過程。為了保證飛秒激光的無畸變傳輸，傳播介

3、質(zhì)有著嚴格的限制；此外，在一般的生物樣本中，相同平均功率和等效激發(fā)波長下，一般雙光子所激發(fā)的光子數(shù)比單光子效應激發(fā)的光子數(shù)少幾個數(shù)量級，所以每次需要把全部的激光都匯聚在一個微米量級的點來提高激發(fā)效率，所以對光學系統(tǒng)的光學性能要求更加苛刻，并且為了得到二維圖像，通常需要通過逐點掃描的方式進行成像。
　　所以針對上述雙光子成像自身特點，微型雙光子顯微鏡需要需要解決如下幾個關鍵技術難題：
　　1.如何將飛秒激光有效的導入微型顯微鏡

4、；
　　2.如何在微型顯微鏡內(nèi)進行掃描/圖像重建；
　　3如何在微型顯微鏡中進行高質(zhì)量的激光匯聚，高效激發(fā)雙光子信號。
　　4.如何有效的對熒光信號進行收集；
　　5.如何使整個系統(tǒng)在動物劇烈運動時仍保持穩(wěn)定；
　　6.在滿足前5項條件下，重量是否足夠輕，以致盡量小地對動物的活動造成影響；
　　課題研究目標：
　　基于前人對于微型雙光子顯微鏡研究開發(fā)的經(jīng)驗和教訓，開發(fā)一系列全新的微型雙光子顯微鏡

5、系統(tǒng)，并制定更加完善和穩(wěn)定的自由活動小鼠神經(jīng)成像方法。
　　課題研究結果：
　　首先，本文分需求，制約和配合三個關鍵點，提出了微型雙光子顯微鏡的設計原則。接著，本文詳細匯報了本課題所研制的第一代微型雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM1.0）。FHIRM-TPM1.0的優(yōu)勢之處在于：顯微鏡探頭僅重2.15克；具有非常高的時空分辨率（橫向0.65μm，軸向3.30μm；40Hz）；是世界上目前唯一一款可以高效的進行GCamP成像的

6、微型雙光子顯微鏡；能夠實現(xiàn)超高速隨機掃描（random scan）和高達10,000 Hz的線掃描（line scan）；FHIRM-TPM1.0在實際的行為學實驗中展示出了極高的性能和穩(wěn)定性：在小鼠進行劇烈的行為活動，比如扭動頭部或進行社交行為時，仍可以進行長達數(shù)小時的神經(jīng)元單樹突棘水平的成像。
　　最后，本文介紹了本人目前在研項目，包括：新一代的微型雙光子顯微鏡；全新的高性能微型成像平臺—TEACH；Z軸掃描的幾種方案；自適應

7、光學微型系統(tǒng)等
　　結論：
　　理論方面，歸納了現(xiàn)有微型雙光子的技術分類和特點，指出了各技術路線中各指標存在的制約關系，提出了微型雙光子顯微鏡的設計原則。技術方面，本課題所研發(fā)的微型雙光子顯微鏡技術克服了先前限制微型雙光子應用的多種障礙，實現(xiàn)了高時空分辨率，良好的機械穩(wěn)定性，以及對應用范圍最廣的指示劑的有效激發(fā)，并進一步研制了全新的高性能微型成像平臺。實驗方面，實現(xiàn)了在自由活動的動物中單突觸水平的長時間成像這一科學家夢寐以求