低氧處理對不同年齡段C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響.pdf

1、背景:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于胚胎早期中胚層和外胚層的多能干細(xì)胞，在體內(nèi)廣泛分布。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)具有支持造血、自我更新、多向分化、免疫調(diào)節(jié)、分泌因子等諸多功能，在組織再生、創(chuàng)傷修復(fù)和多種疾病的治療中有巨大潛力。然而由于BMSCs是一群不均一的細(xì)胞群體，其不同亞群的細(xì)胞表面抗原存在著差異。因此目前BMS

2、Cs表面標(biāo)志物的篩選尚存爭議。BMSCs具有較強(qiáng)的自我更新能力。BMSCs的生長曲線呈S形，在傳代7代之前具有較好的生長特性。BMSCs具有多向分化能力。在不同的誘導(dǎo)條件下，BMSCs可分化為多種造血以外的組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。此外，BMSCs還發(fā)揮著支持造血、調(diào)節(jié)免疫、分泌某些因子的作用。如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)

3、、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)等。
　　除了以上這些優(yōu)良特性，BMSCs

4、還易于提取，易于體外擴(kuò)增，易于外源性基因的導(dǎo)入和表達(dá)。因此BMSCs有望成為細(xì)胞治療和基因治療的有力工具。在多種造血以外的缺陷性疾病、退行性疾病、遺傳性疾病的治療中發(fā)揮重要價值。目前，自體干細(xì)胞移植是BMSCs應(yīng)用于臨床的重要手段，它有如下一些優(yōu)勢:一、細(xì)胞源于每個病人自身，供體來源充足;二、無免疫排斥反應(yīng);三、治療費(fèi)用相對低廉;四、無倫理學(xué)障礙。支持造血是體內(nèi)BMSCs的主要生理作用之一。有報道稱自體BMSCs和外周血造血干細(xì)胞共移植

5、可用于治療惡性血液病。大量報道證實(shí)自體BMSCs移植在骨、軟骨、關(guān)節(jié)等創(chuàng)傷修復(fù)中的良好表現(xiàn):自體BMSCs與同種異體骨支架復(fù)合可治療犬下頜骨節(jié)段性缺損;自體BMSCs與藻酸鹽載體復(fù)合可治療兔關(guān)節(jié)軟骨缺損;自體BMSCs與生物蛋白膠混合注射有利于兔前交叉韌帶重建的術(shù)后恢復(fù);自體BMSCs經(jīng)旋骨內(nèi)動脈灌注可用于治療股骨頭缺血性壞死。一些研究發(fā)現(xiàn)自體BMSCs還可用于組織創(chuàng)傷或組織缺損的修復(fù)性治療:自體BMSCs可用于治療裸鼠皮膚創(chuàng)面;自體B

6、MSCs可以幫助重建兔受損的眼表，減輕水腫，抑制血管生成;自體BMSCs可用于進(jìn)行犬膀胱部分切除修補(bǔ)。此外，自體BMSCs在一些缺血缺氧性損傷的治療中亦能發(fā)揮重要作用（盡管其作用機(jī)制尚未非常明確）:自體BMSCs局部注射可用于療小型豬心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）;經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneouscoronary intervention，PCI)的同時行自體BMSCs冠脈灌注可以

7、抑制AMI患者的左心室重構(gòu)，改善心功能;自體BMSCs局部注射可以改善下肢缺血的血流灌注;自體BMSCs可改善糖尿病足的局部癥狀。自體BMSCs亦可用于神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù):自體BMSCs靜脈注射可改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)功能障礙的癥狀;經(jīng)靜脈自體BMSCs移植可用于治療腦梗死;自體BMSCs血腫腔內(nèi)沖洗有助于腦出血的術(shù)后恢復(fù);自體BMSCs可用于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的治療;自體BMSCs可以用于周圍

8、神經(jīng)損傷的修復(fù);自體BMSCs聯(lián)合外周神經(jīng)移植術(shù)可用于治療脊髓損傷。然而，由于功能性神經(jīng)元不僅要具備典型神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)特征和特異性標(biāo)記，還應(yīng)該具備可興奮性、形成突觸聯(lián)系的能力、產(chǎn)生突觸電位的能力等。因此，BMSCs的神經(jīng)方向誘導(dǎo)是否成功尚存在很大的爭議。但是自體BMSCs在不同器官多種原因引起的功能障礙中也能夠發(fā)揮治療作用:自體BMSCs可用于治療豬急性肝功能衰竭;自體BMSCs移植可促進(jìn)肝硬化SD大鼠模型殘余肝臟再生;自體BMSCs

9、可以緩解異基因小型豬的肝移植急性排斥反應(yīng);自體BMSCs移植可用于治療終末期肝病;自體BMSCs移植可以促進(jìn)兔缺血再灌注損傷后腎臟功能的恢復(fù)和組織結(jié)構(gòu)的修復(fù);自體BMSCs移植可以在急性重癥胰腺炎早期保護(hù)大鼠免受損害;自體BMSCs移植聯(lián)合胰島素或降糖藥治療能有效降低患者血糖，并改善患者諸多臨床癥狀。
　　自體BMSCs移植是充分發(fā)揮BMSCs強(qiáng)大的組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、支持造血等功能的有效手段。因此，有很多學(xué)者致力于將BMSCs應(yīng)

10、用于更廣泛的治療領(lǐng)域。然而自體BMSCs移植受供體年齡的影響很大，隨著人類年齡的增長，BMSCs也隨之發(fā)生著生理性老化。氧化應(yīng)激理論認(rèn)為，隨著人類年齡的增長，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)失衡。隨著大量活性氧的釋放和積累，細(xì)胞逐漸老化甚至凋亡，對應(yīng)的就是器官的衰退甚至衰竭。BMSCs也難逃這樣的規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎BMSCs，增殖能力較強(qiáng)，體外培養(yǎng)時無接觸性抑制，但是分泌功能較差。而在成體BMSCs中，0-20歲之間的BMSCs生物學(xué)特性最優(yōu)。因此，是

11、良好的BMSCs來源。有人認(rèn)為氧化應(yīng)激學(xué)說并不能完美地解釋細(xì)胞老化現(xiàn)象，我們或許能夠找到一種能改善老化個體BMSCs生物學(xué)特性的方法。
　　低氧處理對BMSCs的作用是一個有趣的課題。它似乎給人們提供了一點(diǎn)希望。有人推測由于骨髓里的氧濃度低于其他組織，所以低氧環(huán)境更利于BMSCs的生長。一些實(shí)驗證實(shí):3％O2的持續(xù)性低氧可促進(jìn)人BMSCs的增殖;1％O2的持續(xù)性低氧可促進(jìn)人BMSCs增殖，促進(jìn)集落形成，促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子-1α(hy

12、poxia-inducible factor-1，HIF-1α)的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromalcell-derived factor-1，SDF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌，抑制BMSCs的成骨分化。但是也有相反的結(jié)論:低氧可促進(jìn)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs增殖，但是在無血清條件下則表現(xiàn)為抑制增殖;1％O2濃度是非致死性條件，但是可短暫

13、抑制大鼠BMSCs的增殖。因此，人們認(rèn)為低氧處理對BMSCs的作用與氧濃度大小、作用持續(xù)時間、培養(yǎng)基中的血清濃度、物種等多種因素相關(guān)。
　　目的:適度的低氧處理可能會促進(jìn)BMSCs的增殖。我們計劃在C57小鼠BMSCs上重復(fù)這種處理，并且將這種處理應(yīng)用于增殖能力差的老化C57小鼠BMSCs上，以期促進(jìn)其增殖。
　　方法:我們參考Billups-rothenberg公司的MIC101型細(xì)胞低氧培養(yǎng)系統(tǒng)，并作了相應(yīng)改進(jìn)。自制了一

14、套新型低氧培養(yǎng)裝置。這種裝置的設(shè)計原理是從普通培養(yǎng)箱中引入的含5％ CO2的混合氣體作為氣體來源，在“活性鐵—蛭石—活性炭原電池”消耗了其中的O2之后再供給BMSCs。和MIC101型細(xì)胞低氧培養(yǎng)系統(tǒng)相比，這種裝置無需連接鋼制氣瓶，使用時靈活方便安全可靠。這種裝置可以保證氣體的充分交換，保證測氧儀檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。這種裝置可以在降低O2濃度的同時，維持CO2濃度的穩(wěn)定。根據(jù)The Jackson Laboratory提供的數(shù)據(jù)，C57小

15、鼠出生后3-6周相當(dāng)于人類的20-30歲，C57小鼠出生后18-24個月相當(dāng)于人類的56-69歲。我們選取3-6周C57小鼠作為年輕組，選取18-24個月C57小鼠作為老齡組。全骨髓法獲取3-6周年輕組C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，通過換液、傳代等方法體外擴(kuò)增至第6代。并且選取了其中部分細(xì)胞進(jìn)行凍存。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs作常規(guī)培養(yǎng)，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目，繪制連續(xù)5天的細(xì)胞生長曲線，以證實(shí)年輕組C57小

16、鼠的BMSCs的增殖能力較強(qiáng)。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs作成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)，以證實(shí)年輕組C57小鼠的BMSCs的仍然具有良好的多向分化能力，證實(shí)全骨髓法獲取C57小鼠BMSCs的可行性。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs于5％O2低氧下處理30min，繼而常規(guī)孵育8h。然后用結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的變化。全骨髓法獲取18-24個月老化C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞作原代培養(yǎng)。于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目，繪制連續(xù)

17、12天的細(xì)胞生長曲線。以證實(shí)隨著年齡的增殖，BMSCs的增殖能力減弱。全骨髓法獲取老化C57小鼠的BMSCs較為困難。取接種后72h的老化C57小鼠的骨髓貼壁細(xì)胞于5％O2低氧下處理30min，繼而常規(guī)培養(yǎng)24h，并用結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的變化。
　　結(jié)果:3-6周年輕組C57小鼠BMSCs，可體外擴(kuò)增至第6代，并且保持了多向分化能力。經(jīng)5％O2低氧下處理30min后，呈片狀脫落。18-24個月老化C57小鼠的

18、骨髓貼壁細(xì)胞增殖能力差，經(jīng)12天的原代培養(yǎng)僅形成了一個集落。經(jīng)5％O2低氧下處理30min，并繼續(xù)培養(yǎng)24h后，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且無新的集落形成。
　　結(jié)論:利用全骨髓法可順利地獲取的年輕組C57小鼠的BMSCs。第6代年輕組C57小鼠BMSCs生長良好，并保持了多向分化能力。但低氧處理可損害年輕組的C57小鼠BMSCs的增殖。利用全骨髓法獲取老化C57小鼠BMSCs較為困難，低氧處理可損害老化C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞的原代培