擬南芥ABC轉運蛋白P2SA1在下胚軸向光彎曲中的功能分析.pdf

1、植物向光性可保證其以最佳取向獲得光源，其中藍光受體向光素(PHOT1/PHOT2)在植物向光性中起重要作用，但其信號轉導的機制研究以及新信號組分的確定仍亟待突破。PHOT1可調節(jié)較寬范圍藍光引起的擬南芥下胚軸向光彎曲，而PHOT2僅介導強藍光誘導的下胚軸向光彎曲。該現(xiàn)象既體現(xiàn)PHOT1和PHOT2功能冗余性又表現(xiàn)其作用的特異性。雖已證明向光素PHOT1可能通過橋聯(lián)蛋白NPH3、RPT2和PKS1相互作用，調節(jié)生長素輸出輸入載體如PIN1

2、和AUX1的活性及再定位，然而具體作用機制并不清楚。遺傳分析顯示NPH3和RPT2單基因突變均可導致擬南芥缺失藍光誘導的下胚軸向光彎曲，暗示NPH3和RPT2參與調節(jié)PHOT1和PHOT2介導的下胚軸向光彎曲，然而RPT2僅與PHOT1相互作用，并不與PHOT2互作。PHOT2互作蛋白RCN1的發(fā)現(xiàn)有望揭開PHOT2調節(jié)下胚軸向光彎曲的可能作用機制，然而RCN1負調節(jié)PHOT2介導的向光彎曲，且不與PHOT1互作。ABCB19（生長素外

3、流載體）基因的發(fā)現(xiàn)，可能搭起向光素與生長素之間的橋梁，遺憾的是該蛋白作為向光素的作用底物僅受PHOT1調節(jié)，不能解釋PHOT2調節(jié)下胚軸向光彎曲的機制。
　　PHOT1和PHOT2對擬南芥下胚軸向光彎曲調節(jié)的功能冗余，限制了人們對PHOT2的研究。為此，我們以擬南芥phot1突變體為材料，通過EMS誘變篩選PHOT2下游信號調節(jié)子從而避開PHOT1基因的干擾。目前，成功篩選并克隆到2個基因，分別命名為P2SA1和P2SA2((P)

4、hototropin(2)(S)ignaling(A)ssociated)。P2SA1基因編碼一個ABC家族蛋白，P2SA2被證明是NPH3(Nonphototropic hypocotyl3)的等位基因。亞細胞定位顯示，P2SA1和P2SA2均定位于細胞質膜。P2SA1和P2SA2基因的突變，均可導致擬南芥缺失強藍光誘導的下胚軸向光彎曲反應，類似于 phot1phot2雙突變表型。與P2SA2基因功能不同的是，P2SA1基因的突變并不

5、影響弱藍光誘導的擬南芥下胚軸向光彎曲。構建P2SA1和P2SA2基因的功能回補載體和超表達載體獲得p2sa1 pP2SA1:P2SA1和p2sa235S∷P2SA2植株，發(fā)現(xiàn)其恢復了強藍光誘導的擬南芥下胚軸向光彎曲表型。由上可知，P2SA1可能作為PHOT1和PHOT2下游因子，特異調節(jié)PHOT1和PHOT2介導強藍光誘導的擬南芥下胚軸向光彎曲生長，并不調節(jié)PHOT1介導的弱藍光誘導的擬南芥下胚軸向光彎曲，而P2SA2調節(jié)PHOT1和P

6、HOT2介導的強弱藍光反應。分析P2SA1可能的生物學功能，發(fā)現(xiàn)P2SA1基因的突變也可導致擬南芥葉表面溫度低于野生型和phot1突變體約1℃，然而并不影響擬南芥葉綠體避光運動和擬南芥根負向光性生長。
　　表達分析顯示，強藍光處理顯著誘導擬南芥P2SA1和PHOT2基因的表達，抑制PHOT1基因表達，且PHOT2基因的突變明顯抑制強藍光誘導的P2SA1基因表達，暗示強藍光誘導的擬南芥向光彎曲反應主要由PHOT2調節(jié)，P2SA1可能

7、特異調節(jié)PHOT2介導的藍光反應。然而P2SA1并不與藍光受體PHOT1或PHOT2互作，可與PKS1相互作用。PKS1可以與PHOT1和PHOT2發(fā)生體內體外互作，暗示PKS1可能起到橋梁的作用搭起PHOT1和PHOT2與P2SA1之間信號傳遞。遺傳分析顯示，P2SA1、NPH3、RPT2突變的擬南芥植株，類似于phot1phot2雙突變體表型，缺失強藍光誘導的下胚軸向光彎曲，而PKSs家族基因PKS1、PKS2和PKS4單基因突變沒

8、有表型，雙突變下胚軸向光彎曲明顯降低，三突變完全缺失向光性，類似于phot1phot2、p2sa1-1、nph3-6以及rpt2-2突變體。有趣的是，PHOT1基因突變背景下，RPT2基因的突變并不影響下胚軸向光彎曲反應，而P2SA1、NPH3或PHOT2基因的突變，可導致下胚軸喪失向光彎曲反應。蛋白互作分析顯示，P2SA1并不與NPH3或RPT2相互作用，可以和PKS1、PKS2以及PKS4相互作用，而PKS1可以與NPH3體外互作。

9、綜上所述，藍光受體PHOT1和PHOT2感知藍光，信號傳遞于NPH3和P2 SA1，隨后可能產(chǎn)生依賴和不依賴于RPT2兩條信號傳遞途徑。正常情況下，不依賴RPT2的信號通路可被PHOT1抑制，只有當PHOT1基因突變，才能解除對其抑制作用。PKSs家族蛋白在藍光受體PHOT1和PHOT2感受藍光刺激，向NPH3和P2SA1傳遞過程中扮演重要的角色。
　　生長素的不對稱分布決定植物的向光性，藍光照射引起的生長素分布不均依賴于向光素介

10、導的信號轉導途徑。我們將含有生長素報告基因的DR5rev:GFP/DR5rev:GUS野生型擬南芥與p2sa1-1突變體雜交，獲得p2sa1 DR5rev:GFP和p2sa1 DR5rev:GUS植株。暗處理下生長素主要分布在擬南芥黃化苗子葉彎鉤處，胚軸面強藍光單側刺激可誘導生長素向下轉移形成背光側和向光側生長素的不對稱分布，而子葉面強藍光單側刺激可促使生長素先向背光側轉移，再向下運輸形成生長素不對稱分布。基因P2SA1的突變，可造成擬

11、南芥缺失強藍光誘導的生長素上述轉移反應。與之相吻合的是，胚軸面和子葉面照光可導致擬南芥野生型下胚軸向光彎曲表現(xiàn)明顯差異，然而基因P2SA1的突變，不同側面照光擬南芥均表現(xiàn)為下胚軸向光彎曲缺失。該結果證實P2SA1調節(jié)生長素的運輸，介導擬南芥下胚軸向光彎曲反應。蛋白互作分析顯示，P2SA1并不與生長素運輸載體P1N1和AUX1互作，PKS1可以與PIN1和CAM4發(fā)生體外體內互作。結合前期研究結果NPA（生長素外流載體抑制劑）抑制強藍光誘

12、導擬南芥下胚軸胞質Ca2+升高和向光彎曲反應，表明PKS1可能傳遞P2SA1介導的藍光信號調節(jié)生長素運輸，調節(jié)下胚軸Ca2+變化，介導強藍光誘導的擬南芥下胚軸向光彎曲反應。
　　綜上所述，我們成功篩選并克隆了兩個基因P2SA1和P2SA2，P2SA1基因編碼一個ABC家族蛋白，P2SA2被證明是NPH3的等位基因。P2SA1和P2SA2均定位于細胞質膜，參與調節(jié)強藍光誘導的擬南芥下胚軸向光彎曲反應。研究發(fā)現(xiàn)P2SA1除特異調節(jié)強藍

13、光誘導的擬南芥下胚軸向光彎曲反應外，還參與調節(jié)氣孔運動，然而并不調節(jié)擬南芥葉綠體避光運動和根負向光性反應。P2SA1對擬南芥下胚軸向光彎曲的調節(jié)依賴于其與PKS1互作，以接收PHOT1和PHOT2感知的強藍光信號，調節(jié)生長素的橫向和縱向運輸，促使生長素的不對稱分布，進而導致擬南芥下胚軸不對稱生長，表現(xiàn)向光彎曲。上述結果，將為解析藍光受體PHOT1和PHOT2下游信號調節(jié)子選擇差異，探討植物強藍光應答過程中的信號整合與區(qū)分的基本機制提供新