非諾貝特和替米沙坦對(duì)大鼠胰島素抵抗的影響及其作用機(jī)制的探討.pdf

1、隨著人們生活質(zhì)量的提高和生活方式的改變，肥胖已成為一種新的流行性疾病，并常與其他疾病如高血壓、脂質(zhì)代謝障礙、高胰島素血癥、葡萄糖耐量減低和2型糖尿病并存。這種多種心血管危險(xiǎn)因素的同時(shí)存在，被稱為代謝綜合征。肥胖特別是腹部肥胖是胰島素抵抗和代謝綜合征的主要發(fā)病因素。減輕體重、改善胰島素抵抗已成為臨床治療代謝綜合征的重要目標(biāo)。大量臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)一些血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARBs)亞型用于高血壓治療時(shí)能減少新發(fā)2型糖尿病的出現(xiàn)，減少心血管

2、疾病發(fā)生的危險(xiǎn)。微?；侵Z貝特用于治療高甘油三酯血癥和低高密脂蛋白血癥等脂質(zhì)異常時(shí)也能預(yù)防和延緩冠心病的發(fā)展、改善臨床預(yù)后。但關(guān)于這兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用能否產(chǎn)生更大的臨床益處或出現(xiàn)其它的副作用，目前并不十分清楚。因此，本文的研究目的是探討非諾貝特和替米莎坦對(duì)胰島素抵抗大鼠的胰島功能和糖脂代謝的影響及其可能作用的機(jī)制，為代謝綜合征臨床治療對(duì)策的選擇提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1、材料
　　 健康雄性Wi

3、star大鼠60只（體重140～200g，購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）;微電腦數(shù)字顯示式注射器泵:Perfusor Compact B.Braun;血糖儀:sure step強(qiáng)生（中國）醫(yī)療器材有限公司;大鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒:美國chemicon公司;大鼠腫瘤壞死因子-αELISA試劑盒:晶美公司;總RNA提取試劑異硫氰酸胍(TriozolReagent):美國Invitrogen Life technologies公司;目的基

4、因引物:大連寶生物公司;DNA MARKER DL2000:大連寶生物公司;RT-PCR試劑盒:大連寶生物公司;Protein A標(biāo)記的瓊脂糖凝膠:碧云天公司; PPARα、 PPARγ抗體:santa cruz公司;堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗:北京中山生物技術(shù)有限公司。
　　 2、方法
　　 1)胰島素抵抗動(dòng)物模型的建立
　　 健康雄性Wistar大鼠60只（購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重140-200g。適應(yīng)

5、性喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組(NC組)12只，高脂飼料組(HE組)48只。正常對(duì)照組給予普通標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料（由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），其熱量組成:碳水化合物占63.4％，脂肪占16.2％，蛋白質(zhì)占20.4％。高脂飼料:參考文獻(xiàn)報(bào)道自行配制，其熱量組成為，碳水化合物占20％，脂肪占59％，蛋白質(zhì)占21％。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6只。動(dòng)物房溫度保持在20～24C，濕度在55％～65％，自由光照。實(shí)驗(yàn)期間大鼠可自由攝取食物和水

6、，每日添加飼料和飲水，每周稱重一次。連續(xù)喂養(yǎng)6周，之后將高脂喂養(yǎng)大鼠再根據(jù)體重隨機(jī)分為4組（每組12只）。其中一組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，另外3組在高脂飼料基礎(chǔ)上給予藥物干預(yù)。
　　 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為以下5組:正常對(duì)照組(NC)，高脂飼料組(HF)，非諾貝特（微?；ζ街┙M(F)，替米沙坦（美卡素）組(T)，非諾貝特與替米沙坦聯(lián)合組(F+T)。非諾貝特和替米沙坦分別以30mg/kg體重和4mg/kg體重的劑量給予。每周調(diào)整一次藥物

7、劑量。藥物每周配制一次，冰箱中保存，灌胃方式給藥，每日一次。
　　 2)正常葡萄糖高胰島素鉗夾技術(shù)對(duì)胰島素抵抗大鼠模型的評(píng)價(jià)
　　 第4周末給藥處理結(jié)束時(shí)，隨機(jī)從每一實(shí)驗(yàn)組中選取大鼠4只做葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12小時(shí)過夜，但仍可自由飲水。第二天上午8時(shí)進(jìn)行葡萄糖鉗夾。10％水合氯醛300mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后，仰臥位固定大鼠，燈照以保持大鼠體溫。行頸部正中切口分離右頸靜脈和左頸動(dòng)脈，分別插入兩枚Y型

8、靜脈留置針，縫合線充分固定。頸靜脈通路用于輸注胰島素和葡萄糖，頸動(dòng)脈通路用于取血標(biāo)本檢測葡萄糖濃度。頸動(dòng)脈導(dǎo)管則接一裝有肝素生理鹽水(濃度為5(O)U/ml)的注射器進(jìn)行抗凝。葡萄糖和胰島素輸注速率由微電腦數(shù)字顯示式注射器泵控制。
　　 手術(shù)完畢后先靜止30分鐘，再抽取動(dòng)脈血0.5ml測定基礎(chǔ)血糖和血清胰島素水平，然后以恒定速度輸注胰島素，其速率為4mU/kg·min，每間隔5分鐘采血一次，用自動(dòng)血糖儀測定葡萄糖濃度，當(dāng)血糖低于

9、基礎(chǔ)血糖值時(shí)開始輸注10％的葡萄糖溶液。葡萄糖輸注速率從5mg/kg·min開始，根據(jù)血糖值調(diào)整葡萄糖輸注速率，使血糖值保持在基礎(chǔ)血糖(mmol/L)±0.5mmol/L范圍。當(dāng)連續(xù)3次血糖值均在上述范圍時(shí)即達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)。記錄后一小時(shí)13次葡萄糖輸注速率，取其平均值即為葡萄糖輸注率(glucose infusion rate，GIR)。
　　 3)空腹血糖測定
　　 各組大鼠干預(yù)處理后采用血糖儀檢測清晨空腹鼠尾血糖。<

10、br>　　 4)大鼠血壓測定
　　 干預(yù)處理后每組各取出4只大鼠進(jìn)行有創(chuàng)性頸動(dòng)脈血壓測定。
　　 5)血液標(biāo)本的采集
　　 大鼠禁食12小時(shí)后，10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，立即剪開大鼠腹部皮膚，抽取下腔靜脈血液，立即于4℃恒溫下、2500rpm離心10分鐘，取其血清分裝于1.0mlEP管中-40℃冰箱內(nèi)保存待用。
　　 6)鼠內(nèi)臟標(biāo)本的采取
　　 大鼠處死后，立即取出大鼠附睪脂肪、腎周圍脂肪、

11、肝臟。用濾紙吸干后稱重，標(biāo)本于液氮中速凍后，置于-80℃冰箱中保存待用。
　　 7)血清學(xué)參數(shù)檢測
　　 甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定，采用日立全自動(dòng)生化儀(7600-110)。
　　 血清胰島素濃度測定，采用胰島素放射免疫分析藥盒（北京原子高科股份有限公司）。
　　 血清游離脂肪酸測定，采用游離脂肪酸試劑盒（南京建成生物工程研

12、究所）。
　　 血清脂聯(lián)素和腫瘤壞死因子-α濃度測定，采用ELISA試劑盒（美國chemicon公司，晶美公司）。
　　 8) mRNA表達(dá)檢測
　　 采用RT-PCR方法檢測附睪脂肪中PPARγ、抵抗素和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)，檢測肝臟中PPARαmRNA表達(dá)。
　　 9)蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測
　　 采用Western方法測定肝臟PPARα蛋白的表達(dá)、附睪脂肪PPARγ蛋白的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)

13、果：
　　 1、與CN組相比較，HF組大鼠體重逐漸增加，從第4周開始顯示出兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，這種差異持續(xù)存在至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。HF組空腹血糖、胰島素濃度、甘油三酯、游離脂肪酸明顯高于CN組(P＜0.01)，GIR于HF組明顯低于CN組(P＜0.01)。
　　 2、藥物干預(yù)后F組、T組和TF組大鼠的體重與HF組相比較均明顯減輕(P＜0.01);三組大鼠的GIR與HF組相比較獲得明顯改善(P＜0.01);三組大鼠

14、血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平均有不同程度的下降、高密度脂蛋白膽固醇增高，與HF組大鼠相比較差異性顯著(P＜0.05);高脂組大鼠血清脂聯(lián)素降低(P＜0.05)、血清腫瘤壞死因子濃度明顯升高(P＜0.01)，藥物干預(yù)后，與HF組相比較，聯(lián)合治療組脂聯(lián)素升高最為明顯，P＜0.01;三個(gè)干預(yù)組的腫瘤壞死因子-α濃度明顯下降，P＜0.05或P＜0.01;HF組大鼠的血壓水平明顯升高，P＜0.01;F組大鼠的血壓也有所升高，與N

15、C組大鼠比較，P＜0.05。
　　 3、HF組大鼠PPARα和PPARγ mRNA表達(dá)明顯下降，與NC組相比較，P＜0.01;藥物干預(yù)后，F(xiàn)組和TF組PPARαmRNA表達(dá)明顯明顯增加，與HF組相比較，P＜0.01，T組則無明顯變化;T組和F+T組PPARγ mRNA表達(dá)顯明顯增加，與HF組相比較，P＜0.01，而F組則無明顯變化。
　　 4、PPARα和PPARγ蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與其mRNA表達(dá)變化相類似。Resist

16、inmRNA表達(dá)在HF組最低，與NC組相比較，P＜0.01;F組、T組和F+T組的表達(dá)均增加，P＜0.05;與HF組相比較差異性顯著，P＜0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1、高脂飼料喂養(yǎng)可建立具有臨床代謝綜合征基本特征的大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
　　 2、非諾貝特和替米沙坦均能夠改善胰島素抵抗大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)某些代謝指標(biāo)的異常有進(jìn)一步的改善作用。
　　 3、非諾貝特可使胰島素抵抗大鼠的血壓有

17、所升高，替米沙坦能夠抑制其升高血壓的不利作用。
　　 4、非諾貝特和替米沙坦在改善胰島素抵抗同時(shí)對(duì)細(xì)胞因子有調(diào)節(jié)作用，非諾貝特和替米沙坦聯(lián)合應(yīng)用能額外增加血清脂聯(lián)素水平。
　　 5、胰島素抵抗可使肝臟細(xì)胞PPARαmRNA表達(dá)下降，非諾貝特可使PPARαmRNA表達(dá)增強(qiáng)，附睪脂肪PPARγ mRNA表達(dá)在胰島素抵抗時(shí)也明顯下降，替米沙坦能恢復(fù)其mRNA表達(dá)。
　　 6、菲諾貝特和替米沙坦通過PPARα和 PPAγ