心力衰竭時(shí)大鼠下丘腦室旁核血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和血管緊張素1型受體與NMDA受體相互作用對(duì)交感神經(jīng)活動(dòng)的影響.pdf

1、慢性心力衰竭（簡(jiǎn)稱心衰），是由各種心血管疾病導(dǎo)致心輸出量降低并伴有心功能進(jìn)行性惡化的臨床綜合征，是缺血性心臟病等多種心血管疾病的主要并發(fā)癥。探討其發(fā)病機(jī)制和尋找有效的防治手段是目前心衰研究的熱點(diǎn)課題。而持續(xù)的交感神經(jīng)過度激活是心衰的重要特征，可以促進(jìn)心衰的惡化。因此降低交感神經(jīng)的興奮性成為心衰治療的關(guān)鍵。近年來研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)體液機(jī)制的改變會(huì)使心衰時(shí)已經(jīng)存在的水鈉潴留和交感神經(jīng)激活更加顯著，使心功能進(jìn)一步惡化并形成惡性循環(huán)。并且交感神經(jīng)

2、中樞的激活是構(gòu)成心衰病理機(jī)制的重要因素。因此，關(guān)于心衰時(shí)中樞調(diào)控機(jī)制的研究日益受到重視。
　　 交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元的活動(dòng)完全受下丘腦室旁核（PVN）和延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（RVLM）等心血管中樞的控制。其中室旁核是調(diào)控交感神經(jīng)傳出活動(dòng)的重要中樞位點(diǎn)。心衰時(shí)室旁核神經(jīng)元被激活，使交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，促進(jìn)心衰的發(fā)展。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，主要通過血管緊張素Ⅱ（ANGⅡ）與Atl受體（AT1-R）結(jié)合起作用

3、。心衰時(shí)外周腎素-血管緊張素系統(tǒng)等神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制被明顯激活并且伴有血流動(dòng)力學(xué)改變和交感神經(jīng)活動(dòng)持續(xù)增強(qiáng)。而研究證實(shí)，心血管中樞PVN、RVLM和孤束核等區(qū)域存在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）和AT1-R的表達(dá)，對(duì)心血管功能和交感神經(jīng)的活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。腦內(nèi)ACE主要介導(dǎo)ANGⅡ的產(chǎn)生，中樞ACE的活性在維持正常大鼠腎交感神經(jīng)的基礎(chǔ)緊張性放電中具有重要作用。給正常大鼠室旁核注入ANGⅡ可明顯增強(qiáng)交感神經(jīng)活動(dòng)。因此非常有必要對(duì)RAS的中樞

4、機(jī)制進(jìn)行更深入的探索。
　　 室旁核中含有大量的神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)交感神經(jīng)活動(dòng)和心血管功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。其中最重要的是谷氨酸能系統(tǒng)。研究證實(shí)室旁核中神經(jīng)元激活之所以與心衰有關(guān)，主要是室旁核中谷氨酸能機(jī)制激活導(dǎo)致的。室旁核內(nèi)谷氨酸通過谷氨酸受體參與心血管反射，調(diào)控交感神經(jīng)的傳出活動(dòng)和心血管系統(tǒng)的功能。給正常大鼠PVN內(nèi)微量注入N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）時(shí)，引起血壓升高，心率增快，腎交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)。NMDA受體是谷氨酸離子

5、型受體的一個(gè)主要亞型，由一個(gè)NR1亞基（NMDAR1）和一個(gè)或多個(gè)NR2亞基組成，其功能主要取決于NR1亞基。心衰時(shí)刺激室旁核內(nèi)NMDA受體可使交感神經(jīng)放電增加，室旁核微量注入NMDA受體拮抗劑則出現(xiàn)相反的情況。此外，心衰時(shí)室旁核中去甲腎上腺素增加，引發(fā)的外周交感活動(dòng)增強(qiáng)與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)的調(diào)節(jié)也受PVN中GABA的內(nèi)源性抑制作用所控制，參與交感活動(dòng)的中樞調(diào)節(jié)。心衰時(shí)室旁核中各種神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生改變，參與心血管

6、反射活動(dòng)的調(diào)節(jié)，對(duì)交感神經(jīng)興奮性產(chǎn)生影響。體外研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)同時(shí)表達(dá)AT1-R和NMDAR1的神經(jīng)元使用ANGⅡ處理后，可以觀察到神經(jīng)元NMDAR1蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性增加，AT1-R阻斷劑氯沙坦則可以阻止該現(xiàn)象的發(fā)生，使NMDAR1蛋白表達(dá)不能上調(diào)。神經(jīng)元生存環(huán)境中ANGⅡ增加可以促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)谷氨酸機(jī)制激活，NMDAR1蛋白表達(dá)增加，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)RAS與谷氨酸能機(jī)制之間可能存在相互作用。
　　 在本研究中，我們進(jìn)行了以下工作

7、：采用冠脈結(jié)扎術(shù)建立大鼠心衰模型，經(jīng)微型滲透泵給室旁核內(nèi)持續(xù)微量注入不同的藥物干預(yù)4周后，1、觀察心力衰竭時(shí)大鼠下丘腦室旁核內(nèi)ACE和AT1-R的變化及其對(duì)交感神經(jīng)活動(dòng)的影響；2、觀察心衰時(shí)下丘腦室旁核神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)中NMDAR1、TH和GAD67的變化及其對(duì)外周交感神經(jīng)活動(dòng)的影響；3、通過使用血管緊張素1型受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑研究心衰時(shí)室旁核內(nèi)源性ACE和AT1-R與谷氨酸能機(jī)制發(fā)生的變化，觀察RAS與

8、谷氨酸能機(jī)制之間是否存在相互作用，共同影響交感神經(jīng)的傳出活動(dòng)。
　　
　　 第一章
　　 【目的】心力衰竭時(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，交感神經(jīng)活動(dòng)持續(xù)加強(qiáng)，最終導(dǎo)致心功能不斷惡化。下丘腦室旁核（PVN）是調(diào)控交感神經(jīng)傳出活動(dòng)的重要中樞位點(diǎn)和整合部位。本文主要觀察心衰時(shí)大鼠下丘腦室旁核內(nèi)ACE和AT1-R的變化及其對(duì)心衰發(fā)生發(fā)展和交感神經(jīng)活動(dòng)的影響?！痉椒ā窟x取雄性SD大鼠48只，首先進(jìn)行室旁核插管術(shù)。1周后通過冠

9、脈結(jié)扎術(shù)建立大鼠心衰模型或假手術(shù)模型，同時(shí)室旁核插管連接微型滲透泵分別持續(xù)微量注入AT1-R 阻滯劑纈沙坦（VAL, 0.05μg/h. PVN），血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）賴諾普利（Lisinopril, 0.46μg/h. PVN）或空白對(duì)照藥人工腦脊液（Vehicle, 0.11μl/h.PVN）干預(yù)。4周后經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)觀察心功能；電生理記錄腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)；計(jì)算肺/體重比（Lung/BW）和右心室/體重比（RVW/

10、BW）；免疫組織化學(xué)染色觀察下丘腦室旁核內(nèi)ACE表達(dá)的變化；ELISA 法測(cè)定血漿NE和AngII 含量；Western blot技術(shù)測(cè)定下丘腦室旁核內(nèi)Fra-like和AT1-R蛋白的含量變化?！窘Y(jié)果】與假手術(shù)組比較，心衰大鼠心功能明顯降低：左心室舒張末壓（LVEDP）明顯升高，±dp/dtmax和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）明顯下降，左室前負(fù)荷增加（RVW/BW和Lung/BW 明顯升高，p<0.05）；腎交感神經(jīng)放電明顯增強(qiáng)；血漿NE

11、和AngII濃度增高（p<0.05）；PVN內(nèi)Fra-like、ACE和AT1-R表達(dá)增加（p<0.05）。與空白對(duì)照藥治療的心衰大鼠比較，接受纈沙坦或賴諾普利治療的心衰大鼠LVEDP、RVW/BW和lung/BW 有所降低（P<0.05），±dp/dtmax 升高（P<0.05），LVEF 無明顯改變，PVN 區(qū)域的Fra-like、ACE和AT1-R表達(dá)減少（P<0.05），外周血NE和ANGII下降（P<0.05），腎交感神經(jīng)放電

12、減少（P<0.05）?！窘Y(jié)論】心衰時(shí)PVN 區(qū)域內(nèi)源性的ACE和AT1-R 被明顯激活引起交感神經(jīng)放電增加，心功能明顯減退。
　　
　　
　　 第二章
　　 【目的】室旁核中含有大量的神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)交感神經(jīng)活動(dòng)和心血管功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。其中最重要的是谷氨酸能系統(tǒng)。此外，心衰時(shí)室旁核去甲腎上腺素增加，GABA的內(nèi)源性抑制作用減弱也參與交感活動(dòng)的中樞調(diào)節(jié)。本部分主要探討心衰時(shí)大鼠下丘腦室旁核內(nèi)NMDAR1

13、、TH和GAD67的變化及其對(duì)交感神經(jīng)活動(dòng)的影響?！痉椒ā窟x取雄性SD大鼠36只，首先進(jìn)行室旁核插管。1周后采用冠脈結(jié)扎術(shù)建立大鼠心衰模型或假手術(shù)模型，同時(shí)各組經(jīng)室旁核插管連接微型滲透泵持續(xù)給予特異性NMDA受體阻滯劑AP5（0.02μg/h.PVN）或空白對(duì)照藥人工腦脊液（vehicle, 0.11μl/h. PVN）進(jìn)行干預(yù)。4周后經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)觀察心功能；電生理記錄腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)；計(jì)算肺/體重比（Lung/BW）和右心室/體

14、重比（RVW/BW）；ELISA法測(cè)定血漿NE和AngII含量；免疫組織化學(xué)染色觀察下丘腦室旁核內(nèi)TH表達(dá)的變化；使用Western blot技術(shù)測(cè)定下丘腦室旁核內(nèi)NMDAR1和GAD67蛋白含量變化。【結(jié)果】與假手術(shù)大鼠比較，心衰大鼠心功能明顯下降：左心室舒張末壓（LVEDP）明顯升高，±dp/dtmax明顯降低，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）明顯下降，（p<0.05），左室前負(fù)荷增加（Lung/BW和RVW/BW明顯升高，p<0.05）；

15、腎交感神經(jīng)放電明顯增強(qiáng)，血漿NE和AngII的濃度增高（p<0.05）；室旁核內(nèi)NMDAR1和TH表達(dá)增加，GAD67的表達(dá)減少（p<0.05）。與空白對(duì)照藥治療的心衰大鼠比較，接受AP5治療后心衰大鼠LVEDP、RVW/BW和lung/BW有所降低(P<0.05)，±dp/dtmax升高（P<0.05），LVEF 無明顯改變，室旁核區(qū)域的NMDAR1和TH表達(dá)減少，GAD67表達(dá)增加（P<0.05），外周血NE和AngII濃度下降（P

16、<0.05），腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)減少?！窘Y(jié)論】心衰時(shí)下丘腦室旁核中谷氨酸能機(jī)制（NMDAR1）被明顯激活，TH活性增強(qiáng)，GAD67活性降低，可以使交感神經(jīng)的放電增加，促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。
　　
　　
　　 第三章
　　 【目的】腎素-血管緊張素系統(tǒng)是體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，心血管中樞下丘腦室旁核內(nèi)存在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）和血管緊張素1型受體（AT1-R）的表達(dá)，對(duì)心血管功能和交感神經(jīng)的活動(dòng)具有重

17、要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)室旁核內(nèi)谷氨酸能系統(tǒng)的激活可以增加交感神經(jīng)放電，影響心血管功能。本部分主要探討心力衰竭時(shí)室旁核內(nèi)ACE、AT1-R與NMDA受體之間可能存在的相互作用及其對(duì)外周交感神經(jīng)放電活動(dòng)的影響。【方法】選取雄性SD大鼠60只，首先進(jìn)行室旁核插管術(shù)。1周后采用冠脈結(jié)扎術(shù)建立大鼠心衰模型或假手術(shù)模型，同時(shí)各組室旁核插管連接微型滲透泵持續(xù)給予AT1-R阻滯劑纈沙坦（VAL, 0.05μg/h.PVN），ACEI 賴諾普利（Lisino

18、pril, 0.46μg/h. PVN），特異性NMDA受體阻滯劑AP5（0.02μg/h.PVN）或空白對(duì)照藥人工腦脊液（vehicle, 0.11μl/h. PVN）干預(yù)。4周后經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)觀察心功能；電生理記錄腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)；計(jì)算肺/體重比（Lung/BW）和右心室/體重比（RVW/BW）；免疫組化染色觀察下丘腦室旁核內(nèi)ACE和TH表達(dá)的變化；ELISA法測(cè)定血漿NE和AngII含量；采用Western blot技術(shù)測(cè)定室

19、旁核內(nèi)Fra-like、AT1-R、NMDAR1和GAD67蛋白含量的變化?！窘Y(jié)果】與假手術(shù)組比較，心衰大鼠心功能明顯降低，左心室舒張末壓（LVEDP）明顯升高，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）明顯下降，±dp/dtmax明顯降低（p<0.05），左室前負(fù)荷增加（Lung/BW和RVW/BW明顯升高，p<0.05）；腎交感神經(jīng)放電明顯增強(qiáng)，血漿NE和AngII濃度增高（p<0.05）；室旁核內(nèi)Fra-like、ACE、AT1-R、NMDAR1和

20、TH的表達(dá)增加，GAD67表達(dá)減少（p<0.05）。與空白對(duì)照藥治療的心衰大鼠比較，接受纈沙坦、賴諾普利或AP5治療后心衰大鼠LVEDP，RVW/BW和lung/BW有所降低（P<0.05），±dp/dtmax升高（P<0.05），室旁核區(qū)域的Fra-like、ACE和AT1-R、NMDAR1和TH表達(dá)減少，GAD67表達(dá)增多（P<0.05），外周血NE和ANGII下降（P<0.05）；腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)減少?！窘Y(jié)論】心衰時(shí)室旁核區(qū)域的