雷米普利對(duì)大鼠非梗塞區(qū)心肌膠原及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、心肌梗塞(心梗)后重構(gòu)包括心肌細(xì)胞重構(gòu)和細(xì)胞外間質(zhì)，尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原的重構(gòu)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)非梗塞部位心肌間質(zhì)纖維化和細(xì)胞凋亡的研究以及阻斷RAAS對(duì)其影響的研究尚少，且結(jié)果仍存在分歧。由于心梗后心臟不同部位、不同階段發(fā)生重構(gòu)的刺激因素和變化情況可能有所不同，而不同的腎素血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)對(duì)心肌組織的親和力也可能不同，雷米普利是一種長(zhǎng)效高組織親和力的ACEI，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究梗塞后不同階段非梗塞區(qū)心肌間質(zhì)膠原及細(xì)胞凋亡的變化情

2、況及應(yīng)用雷米普利干預(yù)的結(jié)果。 方法： 1.大鼠心梗模型的制備及隨機(jī)分組：隨機(jī)分為心梗組(100只)、藥物組(100只)及假手術(shù)組(50只)。10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔內(nèi)注射麻醉后仰臥固定，胸部備皮。使心臟暴露于胸腔外，距主動(dòng)脈根部約2-3毫米處穿線，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。將心臟放回正常位置，同時(shí)在切口處放置一膠管并與20ml注射器相連接，至大鼠恢復(fù)自主呼吸后縫合皮膚。假手術(shù)組只掛線而不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，余同前。

3、 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死和心臟標(biāo)本的保存：術(shù)后24h、1周、2周及4周隨機(jī)從各組中各取10-12只大鼠，經(jīng)股靜脈注入氯化鉀，使心室停搏于舒張期，去除心房、大血管及心臟外結(jié)締組織等，留取左心室，稱量左室重量(LVAW)，與體重相除，得出左室相對(duì)重量(LVRW)。用直接測(cè)量法測(cè)量左心室長(zhǎng)軸長(zhǎng)度(L)。 3.心肌石蠟切片HE染色及梗塞范圍測(cè)定：每個(gè)大鼠按順序取第二張5μm石蠟切片，常規(guī)HE染色過(guò)程染色，在放大10倍下獲取包括整個(gè)左室截

4、面的切片圖象，用計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)測(cè)定每張切片上左室截面最長(zhǎng)徑(Dmax)、最短徑(Dmin)、瘢痕弧長(zhǎng)以及心內(nèi)、外膜周長(zhǎng)，計(jì)算左室截面直徑D，球形指數(shù)，梗塞范圍(％)。取梗塞范圍大于20％標(biāo)本進(jìn)入研究隊(duì)列。 4.透射電鏡標(biāo)本制備：取凍存的心肌組織約1 mm3，2.5％戊二醛固定2小時(shí)，PBS沖洗3次，1％0.04(鋨酸)固定2小時(shí)，PBS沖洗后經(jīng)系列酒精、丙酮脫水，Epon-812環(huán)氧樹脂包埋，35℃、45℃、60℃加熱聚合。IX

5、B-V(NOVA)型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛重金屬染色，H-600-TEM透射電鏡觀察和拍照實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 5.原位末端標(biāo)記(TUNEL)法標(biāo)記凋亡心肌細(xì)胞：每一標(biāo)本取三個(gè)不同部位石蠟切片，常規(guī)脫臘入水。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2小時(shí)。0.01 MTBS洗2分鐘×3次后加封閉液50μL/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。用抗體稀釋液1:100稀釋生物素化抗地高辛抗體(取1ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μL)，

6、混勻后50μL/片加至標(biāo)本上。 6.心肌膠原容積密度分?jǐn)?shù)(CVF)測(cè)定：切片脫蠟后蒸餾水洗。半定量分析：每張Messon染色切片在放大400倍下從非梗塞區(qū)獲取切片圖象，隨機(jī)選取4個(gè)視野，通過(guò)測(cè)量選定區(qū)域染色組織的面積，將測(cè)量的面積與觀察下的整個(gè)面積的比例來(lái)作為每個(gè)視野中膠原組織占百分比。富含膠原的血管邊界區(qū)域不包括在測(cè)量范圍內(nèi)。 7.TNF-α、MMP-α及caspase-3免疫組織化學(xué)染色(SP法)：石蠟切片常規(guī)脫蠟至

7、水。陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物強(qiáng)度灰度值測(cè)定：每個(gè)大鼠取一張切片，在放大400倍獲取非梗塞區(qū)切片圖象，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，各組免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物強(qiáng)度用圖像分析系統(tǒng)灰度值表示，取均數(shù)代表其表達(dá)強(qiáng)度。 8.AngⅡ及ALd含量檢測(cè)：稱取左室非梗塞區(qū)心肌100mg剪碎，加入AngⅡ試劑盒中緩沖液0.6ml，在冰浴中進(jìn)行超聲勻漿，勻漿液在4℃下以3000rpm離心20分鐘，取上清液原液及稀釋10倍后液體，分別測(cè)定ALd及AngⅡ含量。

8、 9.逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR.)測(cè)定Ⅰ、Ⅲ型膠原和凋亡基因Bcl-2及p53的mRNA表達(dá)：采用Trizol一步法提取心肌標(biāo)本中的總RNA，按RT-PCR試劑盒步驟完成逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.大鼠一般情況：術(shù)后存活的149只大鼠，在隨后4周的干預(yù)期內(nèi)共死亡2

9、2只，死亡率14.8％。其中24小時(shí)內(nèi)死亡15只；術(shù)后1周死亡6只；術(shù)后2周死亡1只。最終假手術(shù)組存活47只，心梗組存活32只，藥物組存活37只。 2.心肌組織病理學(xué)改變：經(jīng)左冠狀動(dòng)脈永久性結(jié)扎后形成左室前壁透壁性心肌梗塞，梗塞范圍為23-35％。心肌組織24h HE染色顯示梗塞區(qū)心肌纖維溶解斷裂，細(xì)胞淡染，可見(jiàn)大量白細(xì)胞浸潤(rùn)；假手術(shù)組表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 3.左室形態(tài)結(jié)構(gòu)改變：以左室絕對(duì)重量(LVA

10、W)、左室相對(duì)重量(IVRW)、左室截面直徑和球形指數(shù)代表左室重塑指標(biāo)。三組比較，術(shù)后24h，LVAW、LVRW、左室截面直徑和球形指數(shù)尚元統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；手術(shù)1W后，心梗組與假手術(shù)組比較，LVAW、LVRW、左室截面直徑增大，球形指數(shù)縮小，2W-4W最明顯，組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05～0.001)，用雷米普利2W后，上述指標(biāo)有所改善，4W明顯改善(p<0.05)。 4.非梗塞區(qū)心肌CVF的變化：心肌組織Me

11、sson染色顯示，假手術(shù)組間質(zhì)只可見(jiàn)散在亮綠色膠原；術(shù)后24h-1W，心梗組和藥物組間質(zhì)亮綠色膠原與假手術(shù)組基本相似；2W時(shí)心梗組間質(zhì)亮綠色膠原增多；4W時(shí)心梗組間質(zhì)亮綠色膠原明顯增多，而藥物組問(wèn)質(zhì)亮綠色膠原明顯減少。 5.非梗塞區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡：TUNEL染色可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠及術(shù)后24h心梗組和藥物組大鼠非梗塞區(qū)未見(jiàn)凋亡心肌細(xì)胞；術(shù)后lW～4W心梗組和藥物組大鼠心肌組織均分布有TUNEL染色陽(yáng)性心肌細(xì)胞，核呈棕黃色，染色深淺

12、不一，核大小不一。 6.非梗塞區(qū)心肌超微結(jié)構(gòu)：透射電鏡可見(jiàn)假手術(shù)組心肌細(xì)胞核膜完整，核質(zhì)分布均勻，染色較淡，呈細(xì)粒分散狀，胞漿內(nèi)線粒體膜完整，嵴清楚；術(shù)后2W～4W心梗組及藥物組有的心肌細(xì)胞核收縮，染色質(zhì)縮合成塊狀，有的線粒體輕度腫脹、部分空泡化。術(shù)后2W～4W時(shí)心梗組心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞增多，間質(zhì)膠原紆維明顯增多；術(shù)后4W時(shí)藥物組心肌間質(zhì)膠原纖維明顯減少。 7.非梗塞區(qū)心肌TNF-α的變化：假手術(shù)組心肌間質(zhì)只有散在染色極

13、淺的弱陽(yáng)性反應(yīng)。術(shù)后1W-4W，心梗組心肌間質(zhì)可見(jiàn)明顯TNF-α表達(dá)。術(shù)后2w-4w，藥物組TNF-α表達(dá)略少于心梗組。 8.非梗塞區(qū)心肌MMP-9的變化：術(shù)后24h-4W，心梗組和藥物組MMP-9表達(dá)與假手術(shù)組比較均無(wú)增強(qiáng)。灰度值分析顯示，術(shù)后24h-1w2組MMP-9水平與假手術(shù)組比較無(wú)差異，而術(shù)后2w-4W雖然有下降趨勢(shì)，但也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 9.非梗塞區(qū)心肌caspase-3的變化：假手術(shù)組可見(jiàn)散在

14、分布的心肌細(xì)胞，其胞漿具有染成棕黃色的caspase-3產(chǎn)物。術(shù)后24h-1W，心梗組和藥物組具有caspase-3陽(yáng)性染色產(chǎn)物的心肌細(xì)胞與假手術(shù)組相似，免疫組織化學(xué)染色灰度值與假手術(shù)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；術(shù)后2W-4W，2組具有caspase-3陽(yáng)性染色產(chǎn)物的心肌細(xì)胞數(shù)量增多，顏色增濃，免疫組織化學(xué)染色灰度值明顯降低，與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，但藥物組與心梗組間無(wú)差異。 10.非梗塞區(qū)心肌AngⅡ及

15、ALD的變化：術(shù)后24h，除了心梗組AngⅡ水平略有升高外，各組AngⅡ及ALD水平相似(p>0.05)；術(shù)后1W-4W，與假手術(shù)組比較，心梗組AngⅡ水平逐漸升高(p<0.05-0.001)，術(shù)后2W，心梗組ALD也開始明顯升高(p<0.05～0.001)；用藥后2W時(shí)AngⅡ明顯回落(p<0.05)，但繼續(xù)用藥至4w時(shí)，AngⅡ水平仍然很高，且與心梗組比較沒(méi)有回降(p>0.05)，而ALD水平明顯低于心梗組(p<0.05)，但仍高于

16、假手術(shù)組(p<0.05)。 11.非梗塞區(qū)心?、?、Ⅲ型膠原(col-1、col-3)的變化：以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果以Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA與β-actin mRNA灰度值的比值表示。結(jié)果顯示，術(shù)后24h，三組間Ⅰ、Ⅲ型膠原含量相似；術(shù)后1W～4W，心梗組col-3均明顯高于假手術(shù)組(p<0.05)，但4w時(shí)略有下降趨勢(shì)，而用藥后1W～4W均未見(jiàn)明顯下降(P>0.05)；術(shù)后2W-4W，心梗組col-1明顯上升，4W

17、更明顯(p<0.05～0.01)，用藥4W時(shí)col-1明顯回降(p<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(p<0.05)o12.非梗塞區(qū)心肌凋亡基因p53及Bcl-2的變化：以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果以p53及Bcl-2 mRNA與β-actin mRNA灰度值的比值表示。 結(jié)論： 1.大鼠心肌梗塞后1周即發(fā)生了左室重構(gòu)，早期持續(xù)使用雷米普利對(duì)左室重構(gòu)有逆轉(zhuǎn)作用。 2.大鼠心梗2周后非梗塞區(qū)出現(xiàn)間質(zhì)纖維化，可能與局