小鹽芥功能基因組學(xué)的初步研究及AtNHX家族部分成員的功能分析.pdf

1、利用和開發(fā)大面積的鹽漬化土地是當(dāng)今世界普遍關(guān)注的問題之一。利用傳統(tǒng)的育種方法來培育耐鹽作物雖然簡便可行，但進(jìn)展緩慢。近年來植物基因工程的迅速發(fā)展為作物耐鹽性的提高帶來了新的契機(jī)。大多數(shù)植物，尤其是農(nóng)作物對鹽脅迫是敏感的，因此挖掘和克隆具有我國知識產(chǎn)權(quán)的耐鹽基因，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，改良和提高作物的抗逆性，使得它們在鹽漬化土地上正常生長顯得尤為重要。本論文包括兩部分研究方向：構(gòu)建了小鹽芥(The lungiella halophla)可轉(zhuǎn)化的B

2、IBAC文庫，轉(zhuǎn)化擬南芥來篩選耐鹽的轉(zhuǎn)基因植物；擬南芥AtNHX家族成員進(jìn)行功能分析。 在構(gòu)建了小鹽芥的BIBAC可轉(zhuǎn)化文庫的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化了擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)擬南芥植株，建立了可轉(zhuǎn)化外源大片段DNA的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。結(jié)果表明這個(gè)可轉(zhuǎn)化文庫符合預(yù)期要求，共有23，040個(gè)克隆，插入片段長度在50-100kb之間，大約覆蓋了4倍小鹽芥的基因組。 通過對一個(gè)長83kb的BIBAC克隆的插入片斷的序列和擬南芥的基因組序列進(jìn)行分析比較，發(fā)

3、現(xiàn)其中有24個(gè)潛在的基因，3個(gè)反轉(zhuǎn)座子。分析它們的基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，除了一個(gè)同源基因的外顯子個(gè)數(shù)不一樣以外，其它對應(yīng)的擬南芥同源基因的外顯子個(gè)數(shù)都是一樣的；比較同源基因的序列發(fā)現(xiàn)它們在氨基酸或者核苷酸序列上面高度保守，說明它們在進(jìn)化上面的保守性很高。對小鹽芥和擬南芥的共線性分析發(fā)現(xiàn)，它們的共線性程度很高。在小鹽芥上預(yù)測的基因都能在擬南芥對應(yīng)的區(qū)域上找到對應(yīng)的同源基因；這些基因在染色體上的排列順序和方向也是一致的。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些染色體重排的現(xiàn)

4、象，如：倒位、插入、缺失。通過這些比較，我們一方面可以通過比較基因組學(xué)的方法對小鹽芥的這些潛在基因進(jìn)行研究，另一方面可以利用擬南芥豐富的分子標(biāo)記通過圖位克隆的方法克隆小鹽芥中的耐鹽基因。根據(jù)擬南芥AtNHX1的氨基酸序列比對可以確定AtNHX家族的其它5個(gè)成員AtNHX2、AtNHX3、AtNHX4、AtNHX5和AtNHX6。根據(jù)它們氨基酸保守性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，可以將之分成兩組：AtNHX1、AtNHX2、AtNHX3、AtNHX4

5、；和AtNHX5、AtNHX6；通過對它們的基因結(jié)構(gòu)分析也證明這一點(diǎn)。對染色體上的定位分析發(fā)現(xiàn)AtNHX1和AtNHX3,、AtNHX2和AtNHX4、AtNHX5和AtNHX6在同一染色體上面。在擬南芥中過量表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)AtNHX4可以增加植物的耐鹽能力。通過轉(zhuǎn)啟動子-GUS植物的時(shí)空表達(dá)模式研究，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)AtNHX2-GUS植物中整個(gè)生長發(fā)育期、成熟期都可以檢測到GUS表達(dá)。在轉(zhuǎn)AtNHX4-GUS植物中，只在維管束中表達(dá)

6、，尤其根部的維管束表達(dá)強(qiáng)烈。在轉(zhuǎn)AtNHX3-GUS植物中，只在種皮、兩片子葉以及花中檢測到GUS活性，其他時(shí)期均不表達(dá)。在4片葉子時(shí)對轉(zhuǎn)啟動子-GUS植物進(jìn)行脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtNHX2的表達(dá)在ABA、NaCl、冷、熱和干旱脅迫時(shí)變化不大；而在ABA和NaCl的脅迫下，轉(zhuǎn)AtNHX4-GUS的植株中，GUS的活性增強(qiáng)，表明AtNHX4可能參與了植物的脅迫反應(yīng)的調(diào)控：轉(zhuǎn)AtNHX3-GUS的植株中，在兩片子葉時(shí)受熱的脅迫后能檢測到GU