TBX1與HOXD10基因的相互調(diào)控及其對SMAD1基因的影響.pdf

1、TBX1(GeneID:6899)基因?qū)儆赥-box轉(zhuǎn)錄因子家族，后者在種系發(fā)生和進(jìn)化中趨于保守，其成員均包含一個(gè)相同的DNA結(jié)合域即T-box，因而得名。1997年，Chieffo等首次克隆了人的TBX1基因，并將其定位于染色體22q11.21。研究者近期發(fā)現(xiàn)，TBX1基因可能影響包括耳、心臟、甲狀旁腺、胸腺、牙齒等多種組織和器官的發(fā)育，并在精神疾病的發(fā)病中扮演一定的角色。
　　 多項(xiàng)研究提示泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育缺陷與染色體22q

2、11.2微缺失密切相關(guān)，具體的畸形可涉及腎臟、輸尿管/膀胱以及尿道等，總體發(fā)病率高達(dá)36％。TBX1是22q11.2缺失關(guān)鍵區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵基因。圍繞該基因的研究提示，TBX1可能通過劑量依賴形式影響SHH、FGF、WNT以及BMP等相關(guān)信號通路，進(jìn)而調(diào)控包括腎臟、心臟、耳、胸腺、甲狀旁腺在內(nèi)的多種器官的發(fā)育。動物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，Tbx1基因缺失或單倍劑量不足可導(dǎo)致類似于人類22q11.2微缺失綜合征的表型。
　　 目前圍繞TBX1基因的

3、研究主要集中于其與心臟畸形的關(guān)系，而該基因是否與泌尿生殖系統(tǒng)畸形的發(fā)生存在聯(lián)系尚未見報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tbx1和Hoxd10僅在小鼠胚腎發(fā)育的某些特定階段高表達(dá)，提示二者參與腎臟發(fā)育調(diào)控。此外，在小鼠腎臟組織中，Tbx1和Hoxd10之間存在相互影響。
　　 由于人類與小鼠在基因組上存在高度同源性，本研究擬運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制人胚腎細(xì)胞中TBX1和HOXD10基因的表達(dá)，通過觀察二者以及下游基因的表達(dá)情況進(jìn)一步揭示參

4、與腎臟發(fā)育調(diào)控的相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)。
　　 材料與方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、人胚腎細(xì)胞系HEK293
　　 2、Western Blot相關(guān)試劑
　　 3、RT-PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
　　 4、Real-time PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
　　 5、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、HEK293細(xì)胞培養(yǎng)，RNA干擾TBX1及HOXD10基因，檢測干

5、擾效果。
　　 2、通過Western Blot及Real-time PCR，分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測RNA干擾后HEK293細(xì)胞中TBX1及HOXD10的表達(dá)情況。
　　 3、應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)驗(yàn)證SMAD1與TBX1，HOXD10之間的調(diào)控關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、分別針對TBX1和HOXD10基因所合成的三段siRNA對HEK293細(xì)胞中二者的表達(dá)均產(chǎn)生下調(diào)作用，其中

6、沉默效果最為明顯者包括TBX1-588-siRNA和HOXD10-406-siRNA。
　　 2、在HEK293/TBX1-588-siRNA和HEK293/HOXD10-406-siRNA細(xì)胞中，TBX1和HOXD10基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平均存在表達(dá)下調(diào)，但程度有所差異。
　　 3、在HEK293/TBX1-588-siRNA和HEK293/HOXD10-406-siRNA細(xì)胞中SMAD1基因表達(dá)升高，但上調(diào)程度有