川芎嗪?jiǎn)误w對(duì)ALI-ARDS大鼠模型的保護(hù)作用及對(duì)NF-κB的影響.pdf

1、背景：急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distresssyndrome,ARDS)是臨床常見的危急重癥之一,治療困難,死亡率高,是呼吸病學(xué)和危重醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是ARDS的早期階段。ARDS每年發(fā)生率為80/10萬(wàn),病死率40％左右。主要表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥。ALI/ARDS是全身炎癥反應(yīng)綜合征形成的“瀑布樣”鏈鎖效應(yīng)在肺部的表現(xiàn),肺內(nèi)皮細(xì)胞損傷

2、導(dǎo)致的毛細(xì)血管通透性增加,導(dǎo)致肺泡及肺間質(zhì)水腫是ALI/ARDS主要的病理生理改變,炎癥介質(zhì)尤其細(xì)胞因子在ALI/ARDS發(fā)病中的作用日益受到重視,其中TNF-α(Tumornecrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β(Iinterleukin-1β,IL-1β)具有觸發(fā)炎癥反應(yīng)的作用,被稱為“早期反應(yīng)細(xì)胞因子”。近年NF-κB(NuclearFactor-kappa B,NF-κB)與肺損傷的關(guān)系逐漸引起重視。文獻(xiàn)報(bào)道

3、,ALI/ARDS患者或動(dòng)物模型中肺內(nèi)NF-κB活性顯著增加,受NF-κB調(diào)控的TNF-α、IL-1β、VCAM-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)等細(xì)胞因子表達(dá)明顯上調(diào)。可見,NF-κB激活是ALI/ARDS一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),抑制NF-κB活化可能會(huì)有效改善ALI/ARDS過(guò)程,防止NF-κB的激活或抑制其活性已成為治療AIA/ARDS的新途徑之一。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)ARDS患者伴有血

4、小板激活、集聚和微血栓形成,即ARDS患者有促凝傾向,抗凝血蛋白水平下降而促凝蛋白和抗纖溶蛋白等表達(dá)增高,而油酸型ALI/ARDS模型大鼠肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積,促凝血活性明顯增高。目前,對(duì)該綜合征尚缺乏有效的治療,但這并不意味著其前景渺茫。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一種鈣離子拮抗劑,從中藥川芎根莖中提取的活性成分,化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪,廣泛用于治療心腦血管疾病,偶見用于治療各種原因引起的急、

5、慢性呼吸衰竭的臨床報(bào)道。藥理研究表明,TMP具有抑制自由基產(chǎn)生、清除氧自由基、改善血液流變學(xué)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制血小板聚集、抑制纖維化等藥理活性。可見,TMP的主要功效與ARDS的主要病理?yè)p傷環(huán)節(jié),即肺炎變、肺淤血和肺纖維化之間呈現(xiàn)清晰的拮抗趨勢(shì)。因此,我們采用經(jīng)典油酸(Oleic acid,OA)制造ALI/ARDS模型,觀察各組大鼠活動(dòng)行為,測(cè)量動(dòng)脈血氧分壓(Partial pressure of oxygen,PaO2),肺濕

6、/干重比(Wet/dry weight,W/D),肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平和蛋白含量;間接免疫熒光原位檢測(cè)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位比率;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)肺組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá),從整體水平和病理變化的角度觀察TMP對(duì)ALI/ARDS的治療作用,并從核轉(zhuǎn)錄水平探討川芎嗪對(duì)ALI/ARDS大鼠的作用機(jī)制。
　　 目的：⑴明確TMP對(duì)ALI/ARDS模型大鼠有無(wú)治療作用；⑵了解A

7、LI/ARDS模型大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-1β水平表達(dá)變化的基本規(guī)律；⑶了解ALI/ARDS模型大鼠肺組織內(nèi)NF-κB表達(dá)變化的基本規(guī)律；⑷了解TMP對(duì)ALI/ARDS模型大鼠TNF-α、IL-1β炎癥因子及對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的影響；⑸為治療ALI/ARDS尋求新的候選藥物,為豐富中藥現(xiàn)代化的內(nèi)涵奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：雄性SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠,分為對(duì)照組(C組)、模型組(OA組

8、)、藥物組(TMP組)、生理鹽水組(NS組),通過(guò)尾靜脈注射油酸0.15ml/kg誘導(dǎo)ALI/ARDS模型,TMP組在造模后30min腹腔注射TMP100mg/kg(預(yù)實(shí)驗(yàn)中,高劑量100mg/kg病理改善較為明顯),NS組生理鹽水劑量為3ml/kg,并將各組在造模后及給藥后4h,8h,12h分為3個(gè)亞組,每個(gè)亞組大鼠各5只。通過(guò)觀察造模后大鼠的呼吸頻率、皮膚粘膜顏色、活動(dòng)行為初步判斷造模成功與否;測(cè)量動(dòng)脈血氧分壓了解大鼠血氧情況,肺組

9、織濕/干重比值了解肺水腫情況:BCA試劑盒檢測(cè)肺泡灌洗液中蛋白含量了解蛋白滲出情況;肺組織形態(tài)學(xué)觀察,包括肉眼觀察肺組織出血、水腫情況及HE染色了解肺組織的病理學(xué)變化;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluids,BALF)中TNF-α、IL-1β水平,了解炎癥因子變化;采用免疫熒光法檢測(cè)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位

10、比率;蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)肺組織中NF-κB p65的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①OA組在尾靜脈注射油酸后5min出現(xiàn)呼吸頻率增快,與C組相比,OA組在4h增加明顯(P＜0.05),其后無(wú)下降趨勢(shì),皮膚黏膜逐漸出現(xiàn)紫紺,毛發(fā)直立,活動(dòng)減少。TMP組在藥物注射后30min呼吸頻率逐漸下降,與OA組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。OA組4h、8h、12h時(shí)間點(diǎn)的PaO2較C組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),TMP干預(yù)后,

11、PaO2有所升高,在12h組明顯,與OA組個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但仍低于正常組(P＜0.05)。②與C組比較,OA組大鼠肺組織濕/干重比、BALF中蛋白含量顯著增加(P＜0.05),在4h最為顯著,應(yīng)用川芎嗪處理后,TMP組肺組織濕/干重比、BALF中蛋白含量降低(P＜0.05),以TMP組在12h時(shí)最為明顯,但仍然高于正常組(P＜0.05)。③肉眼下正常組肺組織表面光滑,淺粉紅色;OA組肺組織暗紅色,明顯充血

12、水腫,可見廣泛點(diǎn)狀或灶狀出血;TMP組肺組織充血,水腫減輕。光鏡下正常肺泡結(jié)構(gòu)清晰,無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滲出。OA組可見肺灶性出血,肺泡壁增厚,肺泡和肺間質(zhì)水腫,肺泡腔明顯變狹窄,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,不同劑量TMP干預(yù)組病理學(xué)改變減輕,以100mg/Kg高劑量組改善最為明顯。④與C組相比較,OA組TNF-α和IL-1β含量明顯升高,在4h達(dá)高峰,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),與模型組相比,TMP組在注射川芎嗪后4hBAL

13、F中TNF-α和IL-1β含量開始降低,以12h最為明顯,與NS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑤C組陽(yáng)性細(xì)胞少,OA組核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性細(xì)胞增多,TMP組核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性細(xì)胞減少,ImageJ軟件測(cè)定光密度值,模型4h組光密度值高于8h、12h組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),經(jīng)川芎嗪治療后,光密度值降低,TMP組12h最為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。⑥Western blot結(jié)果顯示,C組肺組織抽提物含少量NF-κB p

14、65,AO組較C組明顯升高(P＜0.05),與8h、12h時(shí)間點(diǎn)比較,4h升高最為明顯,TMP組NF-κB p65下降,12h表達(dá)最低,與NS組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴川芎嗪能夠改善ALI/ARDS大鼠肺水腫、出血及肺組織形態(tài)學(xué)改變；⑵川芎嗪能夠改善ALI/ARDS大鼠呼吸窘迫、缺氧的癥狀,對(duì)ARDS可能具有潛在的治療價(jià)值,是治療ARDS較好的候選藥物；⑶川芎嗪能夠減少BALF中INF-α、IL-