土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌定量PCR檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、目的：土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis, FT)和炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis, BA)具有高致病性，是重要的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，給人類(lèi)的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，因此有必要建立一種快速、可靠的檢測(cè)這兩種細(xì)菌的方法。
　　 方法：本研究基于TaqMan熒光探針定量PCR技術(shù)，建立并優(yōu)化定量PCR檢測(cè)體系，針對(duì)特異的染色體序列Aldo/keto reductase醇醛酮還原酶基因(AK

2、R基因)和外膜蛋白基因(fopA)設(shè)計(jì)引物及探針，檢測(cè)土拉弗朗西斯氏菌；針對(duì)位于兩個(gè)毒力相關(guān)質(zhì)粒上的莢膜因子（capA）和致死因子基因（lef）以及染色體上的特異序列(GS)設(shè)計(jì)多對(duì)引物及探針，聯(lián)合檢測(cè)炭疽芽孢桿菌。選擇基因組同源性高的菌種DNA作為模板，評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系的特異性；采用克隆株或減毒株以及強(qiáng)毒株基因組DNA作為模板，評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系的靈敏度。利用克隆株或減毒株污染環(huán)境土壤制備模擬樣品，評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系在快速檢測(cè)與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等實(shí)際應(yīng)

3、用中的表現(xiàn)。分別采用重組質(zhì)粒、克隆株或減毒株以及模擬污染水樣本為模板，在上海消防特勤支隊(duì)的進(jìn)口消防多功能偵檢車(chē)上，與進(jìn)口熒光定量PCR試劑進(jìn)行平行比對(duì)檢測(cè)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系的準(zhǔn)確率與檢出率。
　　 結(jié)果：(1)優(yōu)化篩選出土拉弗朗西斯氏菌染色體上的FT-AKR和FT-fopA片段作為檢測(cè)靶序列，建立了TaqMan熒光定量PCR快速檢測(cè)鑒定土拉弗朗西斯氏菌的反應(yīng)體系及條件，以其他非土拉弗朗西斯氏菌菌種為模板未出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；檢測(cè)克

4、隆株質(zhì)粒的靈敏度均為每個(gè)反應(yīng)體系10拷貝；以土拉弗朗西斯氏菌基因組DNA作為模板的靈敏度試驗(yàn)，AKR-F/R引物對(duì)檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.25pg/μl; fopA-F/R引物對(duì)檢測(cè)靈敏度是2.5pg/μl;用克隆株模擬環(huán)境土壤樣本，兩個(gè)引物對(duì)的檢測(cè)靈敏度分別為440和960CFU/g土壤；盲測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)于靈敏度范圍內(nèi)的陽(yáng)性樣本均能正確識(shí)別，并且能夠正確檢測(cè)出不同濃度的陽(yáng)性樣本。本檢測(cè)體系與進(jìn)口熒光定量PCR試劑對(duì)比檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示：

5、4份不同濃度的陽(yáng)性樣本與2份陰性樣本均能正確識(shí)別；模擬6份污染水樣本檢出率100％，進(jìn)口試劑陽(yáng)性漏檢1份。(2)優(yōu)化篩選出炭疽芽孢桿菌基因組特異序列GS序列和pXOl質(zhì)粒的lef基因、pX02質(zhì)粒的capA基因作為檢測(cè)靶序列，建立了TaqMan熒光定量PCR快速檢測(cè)鑒定炭疽芽孢桿菌的反應(yīng)體系及條件，以其他非炭疽芽孢桿菌菌種為模板未出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；以BA-lef.BA-capA和BA-GS克隆株提取的質(zhì)粒DNA作為模板，capA-F/R和

6、GS-F/R引物對(duì)檢測(cè)靈敏度為每個(gè)反應(yīng)體系10拷貝，lef-FIR引物對(duì)為每個(gè)反應(yīng)體系102拷貝；以炭疽芽孢桿菌Sterne菌株作為模板，lef-F/R和GS-F/R引物對(duì)檢測(cè)靈敏度為1.2xl0-2 CFU/μl:以炭疽芽孢桿菌基因組DNA作為模板，lef-F/R引物對(duì)檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到2.4fg/μl；CapA-F/R引物對(duì)檢測(cè)靈敏度是24fg/μl: GS-F/R引物對(duì)檢測(cè)靈敏度是0.24pg/μl:用炭疽芽孢桿菌Sterne菌株

7、芽孢模擬環(huán)境土壤樣本，lefF/R和GS-F/R引物對(duì)的檢測(cè)靈敏度可達(dá)2x103 CFU/g土壤；盲測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)于靈敏度范圍內(nèi)的陽(yáng)性樣本均能正確識(shí)別，并且能夠正確檢測(cè)出不同濃度的陽(yáng)性樣本。本檢測(cè)體系與進(jìn)口熒光定量PCR試劑對(duì)比檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示：4份不同濃度的陽(yáng)性樣本與2份陰性樣本均能正確識(shí)別；模擬6份污染水樣本檢出率100%，與進(jìn)口試劑檢出率持平。
　　 結(jié)論：本研究建立的土拉弗朗西斯氏菌和炭疽芽孢桿菌的檢測(cè)鑒定體系，方法簡(jiǎn)