水甘油通道蛋白7、9在非酒精性脂肪肝病中治療與預防作用的研究.pdf

1、目的:構建pEGFP-N1-AQP7、pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9重組質粒,驗證其在COS-7細胞中的表達情況,檢測其對L-02細胞AQP9表達的影響及其對L-02細胞脂肪變性的的作用,利用電穿孔的方法將重組質粒轉化進入減毒沙門氏菌構建重組SL7207疫苗株,為AQP7及AQP9在非酒精性脂肪肝病的基因治療奠定基礎。
　　 方法:(1)從人脂肪組織及肝臟組織中提取總RNA,通過RT-PCR獲得AQP7及AQ

2、P9基因,將其克隆到pEGFP-N1質粒上,構建重組質粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,將其轉染COS-7真核表達細胞,通過觀察綠色熒光蛋白的表達、RT-PCR和Western blot檢測其在COS-7中的表達;(2)構建針對人AQP9的干擾質粒pshRNA-AQP9,將其轉染L-02肝細胞,通過RT-PCR和Western blot檢測其抑制效率;(3)將pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9分別

3、轉染油酸誘導脂肪變性的L-02細胞,檢測其對L-02細胞脂肪變性的作用;(4)通過電穿孔的方法將pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9轉化減毒沙門氏菌SL7207并檢驗其表達情況和穩(wěn)定性。
　　 結果:(1)通過RT-PCR獲得AQP7及AQP9基因片斷,成功構建重組質粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,驗證了其在COS-7細胞中表達并與綠色熒光蛋白融合;(2)成功構建pshRNA-AQP9,并

4、篩選出對L-02細胞AQP9干擾效果明顯的重組質粒;(3)成功建立L-02細胞脂肪變性模型,pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9對其脂肪變性程度分別有加重及減輕作用;(4)成功構建重組SL7207疫苗株SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9。
　　 結論:通過油酸誘導建立L-02肝細胞脂肪變性模型,轉染pEGFP-N1-AQP9上調其AQP9的表達可使其脂肪變性程度加重,反之