體外光化學(xué)治療誘導(dǎo)人體免疫耐受的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目前器官移植已成為治療相應(yīng)器官嚴重功能障礙的重要手段。肝移植是目前治療各種終末期肝病唯一有效的方法。免疫抑制劑的使用是預(yù)防肝移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的主要手段,但也能引起患者機體代謝的失衡和許多副作用。如何減少肝移植受者免疫抑制劑的使用,已經(jīng)成為移植學(xué)家們追求的目標。體外光化學(xué)療法(extracorporealphotopheresis,ECP)于1987年引進國內(nèi)并用于治療器官移植排斥反應(yīng),臨床觀察到有一定的療效。ECP是指將患者外周血處

2、理后并從中分離出單個核細胞,再經(jīng)光敏劑8-甲氧基補骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP)和長波紫外線(long wave ultraviolet,UVA)聯(lián)合作用后回輸入病人體內(nèi)的一種血液單采光化學(xué)療法。但ECP作用的具體機制至今尚未清楚。越來越多的證據(jù)表明,ECP主要是抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)的功能調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)的誘

3、導(dǎo)作用。在體內(nèi)凋亡細胞攝取的單核細胞和巨噬細胞可產(chǎn)生免疫抑制調(diào)節(jié)作用也是ECP發(fā)揮負向調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。ECP在以往的研究中主要集中在誘導(dǎo)移植受者的免疫耐受。我們首次用肝移植供者的脾臟和外周血為實驗材料,研究脾淋巴細胞的凋亡,和未成熟樹突狀細胞(imature dendritic cells,imDC)的生成,有一定的創(chuàng)新性且有助于進一步更好的研究受者的免疫耐受機制。本實驗就聯(lián)合應(yīng)用UVA和8-MOP誘導(dǎo)肝移植供者脾淋巴細胞的早期凋亡,并用供

4、-者的外周血經(jīng)rhGM-CSF、IL4誘導(dǎo)產(chǎn)生imDC,旨在為進一步研究移植受者的負向免疫調(diào)節(jié)機制提供理論基礎(chǔ)。
  1、UVA聯(lián)合8-MOP誘導(dǎo)人脾淋巴細胞凋亡
  首先獲取肝臟移植供者的脾臟(人脾臟來源于解放軍第309醫(yī)院全軍器官移植研究所肝膽外科肝臟移植供者,肝源供者已簽署相關(guān)知情同意書并經(jīng)309醫(yī)院倫理委員會批準,符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)有關(guān)移植的系列規(guī)定),制備成淋巴細胞懸液,根據(jù)處理方式不同分為單純UVA處理組(UVA組)

5、、單純8-MOP處理組(8-MOP組)、UVA聯(lián)合8-MOP處理組(聯(lián)合組)、未經(jīng)UVA照射和未添加8-MOP處理組(空白對照組)。每組3例(多次進行反復(fù)實驗)。UVA組于37℃50 mL/L CO2孵箱中孵育20 min,采用照射強度為2 J/cm2的光照輻射儀在無菌照射臺上照射9 min,距UVA光源距離為20cm;8-MOP組先加入200 ng/mL8-MOP,再置于37℃50 mL/L CO2孵箱中孵育20 min;聯(lián)合組先加入

6、200 ng/mL8-MOP,置于37℃50 mL/L CO2孵箱中孵育20 min后再將此人脾淋巴細胞懸液放于照射強度為2 J/cm2,距UVA光源20 cm的無菌照臺上,照射9 min;空白對照組僅單純培養(yǎng)人脾淋巴細胞。將上述不同處理后的人脾淋巴細胞懸液用RPMI1640培養(yǎng)液1200 r/min離心5 min,反復(fù)洗滌2次,再用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含100 mL/L胎牛血清)重懸細胞懸液,置于37℃50mL/L CO2孵箱

7、中培養(yǎng)過夜。24h后用annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒各組進行染色,用流式細胞儀檢測經(jīng)不同處理后的人脾淋巴細胞的早期凋亡率。
  2、肝移植供者外周血制備未成熟的樹突狀細胞
  首先獲取肝移植供者的外周血約10ml(血液來源于解放軍第309醫(yī)院全軍器官移植研究所肝膽外科肝臟移植供者,肝源供者已簽署相關(guān)知情同意書并經(jīng)309醫(yī)院倫理委員會批準,符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)有關(guān)移植的系列規(guī)定),等量置于兩個15ml離心管內(nèi),

8、標記為誘導(dǎo)組和對照組,分別加入等量的人外周血淋巴細胞分離液,分離出單個核細胞,再分別加10mlRPMI1640洗滌兩次后,于顯微鏡下計數(shù)活細胞數(shù),保證細胞存活率>95%。調(diào)整細胞濃度為1×106個/L,分別接種于兩個6孔培養(yǎng)板(誘導(dǎo)組6例,對照組6例),置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,清除懸浮細胞,兩組均加入rhGM-CSF(500u/ml)2ul、rhIL-4(1000u/ml)8ul吹打,混勻;48h后兩組均半量換液,加入

9、rhGM-CSF(500u/ml)1ul、rhIL-4(1000u/ml)4ul吹打,混勻;96h后誘導(dǎo)組保持不變,對照組加入rhTNF-α3ul吹打,混勻,培養(yǎng)2天。在培養(yǎng)第6天,光鏡下觀察各組細胞的形態(tài)特征,再分別收取各組的6個培養(yǎng)孔的貼壁細胞。用PE或FITC標記的CD80、CD83、CD11a和CD86抗體,流式細胞儀檢測DC的表型。
  結(jié)果發(fā)現(xiàn):1、UVA聯(lián)合8-MOP誘導(dǎo)人脾淋巴細胞凋亡:聯(lián)合組的人脾淋巴細胞的早期凋

10、亡率為(98.45±0.54)%,明顯高于其他三組(P<0.01)。UVA組和8-MOP組均高于對照組(P<0.01)。各組的總凋亡率和早期凋亡率:聯(lián)合組的總凋亡率和早期凋亡率分別為(99.36±0.39)%,(98.45±0.54)%;8-MOP組分別為(69.55±0.46)%,(64.68±0.74)%;UVA組的分別為(65.42±0.36)%,(61.05±0.90)%;對照組分別為(15.53±0.45)%,(13.67±0

11、.54)%。
  2、肝移植供者外周血制備未成熟的樹突狀細胞:光鏡下可見,培養(yǎng)第6天時,誘導(dǎo)組細胞呈圓形,突起較少,呈現(xiàn)imDC狀態(tài)。對照組細胞外周可見突起和絨毛,表面結(jié)構(gòu)較完整,樹突狀結(jié)構(gòu)明顯,呈現(xiàn)成熟的樹突狀細胞(mature dendritic cells,mDC)的狀態(tài)。流式細胞儀檢測樹突狀細胞的表型:誘導(dǎo)組在培養(yǎng)第6d檢測CD80為(22.63±3.56)%,CD86為(16.39±4.72)%,CD83為(8.58±1

12、.72)‰CD11c為(70.56±10.22)%,符合imDC的表現(xiàn);對照組在培養(yǎng)6d時檢測CD80含量為(53.82±5.46)%,CD86含量為(46.65±6.35)%,CD83含量為(80.56±16.45)%,CD11c含量為(82.32±11.61)%,符合mDC的表現(xiàn)??梢?,誘導(dǎo)組樹突狀細胞的CD80、CD86、CD83、CD11c的含量均顯著低于對照組(P<0.01),且在光鏡下呈現(xiàn)出imDC的狀態(tài)。兩組檢測指標和細胞

13、的形態(tài)相符合。由此可知,用rhGM-CSF聯(lián)合rhIL-4的培養(yǎng)方法可成功用肝移植供者的外周血培養(yǎng)出imDC。
  本實驗用ECP方法成功誘導(dǎo)出大量人脾臟凋亡細胞,尤其是早期凋亡細胞,實驗結(jié)果顯著高于其他各個處理組和空白對照組。在體外用rhGM-CSF+rhIL-4的方法可成功用肝移植供者的外周血培養(yǎng)出imDC,且在光鏡下呈現(xiàn)imDC的形態(tài)特征。早期凋亡人脾淋巴細胞和imDC在肝移植受者的負向免疫調(diào)節(jié)作用中至關(guān)重要,我們前期的實驗

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