HIF-1α介導(dǎo)BMSCs復(fù)合PLGA修復(fù)大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用HIF-1α基因修飾SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，體外實(shí)驗(yàn)檢測目的基因調(diào)控BMSCs成骨和成血管向分化的作用，并構(gòu)建HIF-1α介導(dǎo)BMSCs復(fù)合PLGA支架材料血管化組織工程骨，通過觀察其在大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損中的修復(fù)效果，探索目的基因雙重調(diào)控作用，為將來臨床上修復(fù)骨缺損提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)，奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法:體外分離和培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，構(gòu)建慢病毒載體 Lenti-HIF-1α

2、，并用該載體轉(zhuǎn)染 BMSCs，在轉(zhuǎn)染后的1~7d鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞生長狀態(tài)，確定該載體最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI值；運(yùn)用MTT比色分析法檢測HIF-1α對(duì)BMSCs增殖的影響。在Lenti-HIF-1α轉(zhuǎn)染 BMSCs的第1天、第4天、第7天、第14天和第21天提取mRNA，利用 RT-PCR檢測關(guān)鍵性成血管因子VEGF和成骨因子OCN的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染目的基因HIF-1α的BMSCs與支架材料PLGA共培養(yǎng)構(gòu)建復(fù)合體，掃描電鏡觀察BMSC

3、s和轉(zhuǎn)染目的基因HIF-1α后的BMSCs在PLGA支架材料上的附著生長情況及材料的形態(tài)。并用上述構(gòu)建的細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)復(fù)合體修復(fù)SD大鼠顱骨雙側(cè)直徑5mm的標(biāo)準(zhǔn)骨缺損(n=18)，隨機(jī)分為三組：實(shí)驗(yàn)組植入HIF-1α-BMSCs/PLGA復(fù)合體(n=6)，對(duì)照組植入BMSCs/PLGA復(fù)合體(n=6)，材料組僅植入PLGA支架材料(n=6)。術(shù)后8周處死大鼠并取材，分別行大體觀察、X線片檢查和HE染色觀察大鼠顱骨缺損區(qū)骨修復(fù)效果。

4、收集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:普通顯微鏡下可見BMSCs呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或多角形，旋渦狀生長。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)=12時(shí)，Lenti-HIF-1α轉(zhuǎn)染BMSCs的效率最高，并且在病毒轉(zhuǎn)染后的第7天，鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上，MTT比色分析法檢測結(jié)果顯示HIF-1α對(duì)細(xì)胞的增殖無顯著影響(P＞0.05)；RT-P

5、CR結(jié)果顯示，與單純BMSCs相比，Lenti-HIF-1α轉(zhuǎn)染BMSCs后的第4天、第7天、第14天和第21天，可明顯促進(jìn)成血管因子VEGF的表達(dá)，目的基因轉(zhuǎn)染后的第7天、第14天和第21天，能明顯促進(jìn)成骨因子OCN的表達(dá)(P<0.05)。掃描電鏡結(jié)果顯示單純 BMSCs及轉(zhuǎn)染目的基因 HIF-1α后的 BMSCs均可于支架材料PLGA的表面附著生長，且PLGA支架材料呈三維立體多孔狀結(jié)構(gòu)。SD大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的修復(fù)效果通過大體觀察