食源性肥胖大鼠和肥胖抵抗大鼠下丘腦的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、隨著人們生活水平的提高，肥胖人口在全球范圍內(nèi)不斷增多，肥胖誘發(fā)的相關(guān)疾病也日趨嚴(yán)重，威脅著人類的健康，加重了社會(huì)負(fù)擔(dān)。肥胖的產(chǎn)生主要是由于攝入的熱量過多，在體內(nèi)形成脂肪堆積造成的。在維持機(jī)體能量平衡的過程中，下丘腦發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦能夠釋放具有刺激或抑制攝食作用的神經(jīng)多肽，如神經(jīng)肽Y(NPY)和a-黑色素細(xì)胞刺激促激素(a-MSH)等，通過調(diào)控?cái)z食行為維持機(jī)體能量平衡。隨著研究的深入，不斷有新的信號(hào)蛋白被發(fā)現(xiàn)對(duì)肥胖的

2、產(chǎn)生發(fā)揮了重要作用，以往的理論已不能完全解釋肥胖產(chǎn)生的原因。
　　 目的：本研究旨在通過對(duì)DIO和DR大鼠下丘腦的蛋白組學(xué)研究，篩選并鑒定下丘腦差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，揭示下丘腦內(nèi)攝食相關(guān)蛋白質(zhì)和神經(jīng)肽在肥胖發(fā)展過程的作用，為肥胖的防治提供新的靶標(biāo)。
　　 方法：
　　 1.建立DIO-DR大鼠模型。
　　 2.采用雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis，2DE

3、)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization timeof flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)的技術(shù)篩選并鑒定DIO-DR大鼠下丘腦差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　 3.進(jìn)一步運(yùn)用熒光差異雙向電泳(two-dimensional differential in-geleletrophoresis，2D-DIGE)結(jié)

4、合串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)的技術(shù)篩選并鑒定DIO-DR大鼠下丘腦差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　 4.利用免疫組化和western blotting的方法對(duì)DIO-DR大鼠下丘腦部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)(包括PDI、GSTM1、SNAP-25等)進(jìn)行定位和定量的檢測，并對(duì)其功能展開深入研究。
　　 結(jié)果：
　　 一.DIO和DR大鼠表型差異：
　　 1.DIO大鼠與DR大鼠初始體重相當(dāng)，給予高脂飲食后

5、，DIO大鼠體重增長速度快于DR大鼠，每日平均攝食量多于DR大鼠。
　　 2.DIO大鼠腓腸肌、睪丸和心臟的重量與DR大鼠相當(dāng)，而內(nèi)臟脂肪含量如附睪、腎周脂肪重量明顯高于DR大鼠。
　　 3.DIO大鼠的甘油三酯、自由脂肪酸水平高于DR大鼠，而DR大鼠與普通飼料對(duì)照組水平相當(dāng)。
　　 4.Elisa檢測發(fā)現(xiàn)在肥胖早期(4周)和中期(8周)DIO大鼠的血清瘦素、胰島素水平與對(duì)照組和DR組相比沒有明顯差異；而在肥胖后

6、期(14周)DIO大鼠血清瘦素、胰島素水平明顯高于DR組(p<0.05)，DR大鼠水平與對(duì)照組無顯著性差異，提示DIO大鼠長期高脂喂養(yǎng)后出現(xiàn)瘦素抵抗和胰島素抵抗。
　　 二.2DE結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)DIO-DR大鼠下丘腦進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選和鑒定：
　　 1.篩選并鑒定出22種蛋白質(zhì)，其中7種在DIO組呈高表達(dá)，7種下調(diào)，6種在DR組高表達(dá)，6種下調(diào)。
　　 2.這22種蛋白質(zhì)分別屬于抗氧化蛋白(PRDX1，GS

7、TM1)、細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白(UCHL-1)、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、細(xì)胞骨架蛋白及未知蛋白等不同類別。
　　 三.2D-DIGE結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)DIO-DR大鼠下丘腦進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選和鑒定：
　　 1.運(yùn)用2D-DIGE篩選出42個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS/MS)鑒定出33種蛋白質(zhì)，其中DIO組與對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)的有9個(gè)，下調(diào)的有2個(gè)；DIO組與DR組相比表達(dá)上調(diào)的有8個(gè)，下調(diào)的有9個(gè)；DR

8、組與對(duì)照組相比上調(diào)的有8個(gè)，下調(diào)的有4個(gè)。
　　 2.將2D-DIGE結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與2DE結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，2D-DIGE所需樣品量少，敏感性和特異性更高，篩選出更多的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。而串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)也比一級(jí)質(zhì)譜鑒定出更準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，得到更信服的結(jié)果。這33個(gè)蛋白質(zhì)其中部分與2DE結(jié)合一級(jí)質(zhì)譜的鑒定結(jié)果相一致，主要包括抗氧化蛋白、分子伴侶、細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白、突觸相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等幾個(gè)類別，其中抗氧化蛋白1(PR

9、DX1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶1(GSTM1)、二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)、泛素C末端水解酶L1(UCHL1)等可能與肥胖的發(fā)生有密切的聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)了動(dòng)力蛋白1(Dynamin1)和SNAP-25等新的信號(hào)蛋白。
　　 四.免疫組化和western boltting方法對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行定位和定量的研究
　　 1.免疫組化發(fā)現(xiàn)PDI、PRDX1和Dynaminl在DIO大鼠下丘腦陽性表達(dá)增強(qiáng)；SNAP-25在DIO大鼠下丘腦表達(dá)下調(diào)

10、，在DR大鼠下丘腦表達(dá)上調(diào)。
　　 2.western blotting檢測發(fā)現(xiàn)Dynaminl在DIO組表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組和DR組相比具有顯著性差異；PDI、PRDX1和GSTM1在DIO組表達(dá)上調(diào)且在DR組表達(dá)下調(diào)(與對(duì)照組相比)；UCHL-1和SNAP-25在DIO組表達(dá)下調(diào)且在DR組表達(dá)上調(diào)(與對(duì)照組相比)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立了DIO-DR大鼠模型，與人類肥胖具有很多相似的特征。