MiRNAlet-7d在牙鲆變態(tài)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)及其靶基因預(yù)測(cè).pdf

1、牙鲆是重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，在其早期生活史有一從仔魚(yú)向稚魚(yú)轉(zhuǎn)變的變態(tài)發(fā)育過(guò)程。最明顯的變態(tài)現(xiàn)象是右眼轉(zhuǎn)移到身體左側(cè)，兩只眼睛同時(shí)位于身體左側(cè)。這是脊椎動(dòng)物中最為典型的左右不對(duì)稱發(fā)育的現(xiàn)象，涉及到一系列的生理生化，形態(tài)結(jié)構(gòu)和行為方式的改變。
　　 MicroRNA(MiRNA)是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，在細(xì)胞內(nèi)由約70核苷酸的pre-miRNA經(jīng)Dicer酶剪切加工而來(lái)，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及病毒中，在轉(zhuǎn)錄后對(duì)

2、靶基因的表達(dá)實(shí)施調(diào)控。最初發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)miRNA(lin-4，let-7)，與線蟲(chóng)的時(shí)序發(fā)育相關(guān)。MiRNA與其靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'-UTRs)互補(bǔ)配對(duì)，激活核蛋白復(fù)合體，對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割或翻譯抑制，從而參與調(diào)控基因表達(dá)。近年來(lái)，大量的研究證明，miRNA參與了許多重要的生物學(xué)過(guò)程，在生物的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。小分子RNA(miRNA)基因?qū)ρ丽易儜B(tài)的影響，目前這方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究采用Solex

3、a測(cè)序的方法對(duì)牙鲆變態(tài)階段的總RNA進(jìn)行了檢測(cè)。Solexa測(cè)序結(jié)果表明，變態(tài)期的牙鲆RNA中包含10個(gè)let-7家族miRNA(let-7a，let-7b，let-7c，let-7d，let-7e，let-7f，let-7g，let-7h，let-7i，let-7j)。其中l(wèi)et-7d與let-7家族其他成員(let-7a，let-7b，let-7c，let-7e，let-7f，let-7g，let-7h，let-7i，let-7j)

4、相比，在變態(tài)過(guò)程中的拷貝數(shù)最多，表明在變態(tài)過(guò)程中，相對(duì)于其他成員，let-7d扮演著更重要的角色。莖環(huán)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，let-7d在變態(tài)發(fā)育的每個(gè)時(shí)期(孵化后17，20，23，29，36，41天；17dph；20dph，23dph，29dph，36dph，41dph))均表達(dá)，在前5個(gè)時(shí)期，其表達(dá)量緩慢上升，在變態(tài)末期(36dph)，其表達(dá)量達(dá)到頂峰，隨后有下降的趨勢(shì)(41dph)。熒光定量數(shù)據(jù)顯示，let-7d在所有檢測(cè)的組織

5、(鰓、心臟、胃、脾臟、肝臟、腸、腦、肌肉、腎、生殖腺)中均表達(dá)，其在頭部(腦，鰓，心臟)，尤其在腦部的表達(dá)量較高，暗示其在維持頭部形態(tài)方面起著重要的作用。外源性甲狀腺激素促進(jìn)牙鲆的變態(tài)，但具體的機(jī)制仍有待研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在喂養(yǎng)過(guò)程中添加外源性甲狀腺激素，研究甲狀腺激素對(duì)let-7d的表達(dá)水平的影響，定量結(jié)果表明，外源性甲狀腺激素下調(diào)let-7d的表達(dá)，抑制了let-7d的轉(zhuǎn)錄，但與對(duì)照組相比，let-7d的表達(dá)模式未發(fā)生任何的變化，同樣

6、在首先5個(gè)階段逐漸上調(diào)，在36dph達(dá)到高峰，隨后有下降的趨勢(shì)?？梢?jiàn)外源性甲狀腺僅改變了let-7d的表達(dá)水平，對(duì)let-7d的功能沒(méi)有重大的影響。對(duì)牙鲆基因組DNA進(jìn)行克隆，得到let-7d前體序列，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，牙鲆let-7d前體序列與其他物種的let-7d前體序列同源性較高，體現(xiàn)了miRNA進(jìn)化的高度保守性。MiRNA的功能主要是通過(guò)靶基因表現(xiàn)出來(lái)，靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，30個(gè)牙鲆mRNA的3’-UTRs存在let-7d的結(jié)合位點(diǎn)