PsGK4和PsIMPA1調(diào)控大豆疫霉無(wú)性繁殖過(guò)程中相關(guān)因子的初步鑒定.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根腐病是大豆生產(chǎn)上的主要病害之一，每年給全世界的大豆生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。如何防控大豆疫霉根腐病是生產(chǎn)中面臨的重要問(wèn)題。在大豆疫霉的生活史中，其無(wú)性繁殖可以產(chǎn)生孢子囊，孢子囊在合適的條件下釋放大量游動(dòng)孢子并進(jìn)行傳播，導(dǎo)致大豆發(fā)病成災(zāi)。在田間傳播過(guò)程中，大豆疫霉釋放游動(dòng)孢子識(shí)別寄主根部分泌的化學(xué)物質(zhì)，依靠趨化性定向游動(dòng)，從而定殖到大豆根部。因此，探究大豆疫霉孢子囊的發(fā)育、游動(dòng)孢子

2、的釋放及其趨化性等無(wú)性繁殖過(guò)程中的分子機(jī)制，有助于我們發(fā)現(xiàn)該類(lèi)病害防控的分子靶標(biāo)，為抗病分子設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。
　　在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中，已經(jīng)對(duì)大豆疫霉無(wú)性繁殖過(guò)程中相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。發(fā)現(xiàn)G蛋白信號(hào)途徑中的G蛋白α亞基編碼基因PsGPA1沉默后顯著影響游動(dòng)孢子的趨化性，G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）編碼基因PsGPR11沉默突變體的休止孢萌發(fā)率與野生型相比下降40％左右

3、，另一個(gè)基因PsGK4則顯著影響無(wú)性發(fā)育時(shí)休止孢的萌發(fā)以及游動(dòng)孢子的趨化性;MAPK信號(hào)通路中的MAPK編碼基因PsMPK7沉默后，休止孢萌發(fā)后芽管畸形，同時(shí)對(duì)大豆的致病力也明顯下降，而PsMPK1則參與調(diào)控大豆疫霉的菌絲生長(zhǎng)和游動(dòng)孢子形成;沉默核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程相關(guān)的一個(gè)親核蛋白編碼基因PsIMPA1后，孢子囊的萌發(fā)率及致病力明顯下降;SNARE蛋白家族基因PsSYP6的沉默顯著影響孢子囊的產(chǎn)量及其正常發(fā)育。為了進(jìn)一步鑒定更多的大豆疫霉無(wú)性

4、繁殖相關(guān)因子，并探索他們之間的相互關(guān)系，本研究以前期鑒定的PsGK4和PsIMPA1為基礎(chǔ)，擬分別篩選其相關(guān)的互作蛋白和轉(zhuǎn)錄水平上有聯(lián)系的相關(guān)基因。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　大豆疫霉G蛋白偶聯(lián)受體PsGK4的互作蛋白篩選。前期研究發(fā)現(xiàn)PsGK4對(duì)游動(dòng)孢子的游動(dòng)性、異黃酮的趨化性和病菌的致病力有重要貢獻(xiàn)，且PsGK4在細(xì)胞中定位在囊泡結(jié)構(gòu)上。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選PsGK4的互作蛋白可能對(duì)了解其相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，理解疫霉菌無(wú)性繁殖和游動(dòng)孢

5、子趨化性的分子機(jī)制等具有重要的意義。本研究通過(guò)免疫共沉淀的方法篩選大豆疫霉PsGK4的互作蛋白，共獲得了70個(gè)候選互作蛋白。由于PsGK4的全長(zhǎng)蛋白難以表達(dá)，我們最終使用其N(xiāo)端57個(gè)氨基酸的亞結(jié)構(gòu)域（GPCR七次跨膜域中第一個(gè)囊泡膜外的肽段）。通過(guò)被鑒定肽段的匹配數(shù)及對(duì)候選互作蛋白的功能預(yù)測(cè)，我們最終挑取了3個(gè)蛋白進(jìn)行深入的研究，包括:Ps330899、Ps359771和Ps247465。其中Ps359771蛋白含有一個(gè)烯醇化酶功能域(

6、Enolase domain，因此將其命名為PsEnol)，烯醇化酶在真核細(xì)胞表面可以作為人體凝血酶原的受體參與調(diào)控肌肉生成和瘤組織的發(fā)展;Ps247465蛋白含有一個(gè)Sec23 domain(命名為PsSec23)，該類(lèi)蛋白是COPII型囊泡外被蛋白復(fù)合體的組分之一，可以介導(dǎo)囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的定向運(yùn)輸;Ps500558蛋白含有一個(gè)Rab-GTPase-TBC domain（命名為PsRGTC），可能與囊泡蛋白復(fù)合體互作來(lái)調(diào)控囊泡

7、的定向運(yùn)輸過(guò)程。通過(guò)原核誘導(dǎo)表達(dá)在體外分別進(jìn)行上述蛋白與PsGK41-57aa肽段的GST Pull-down互作驗(yàn)證，初步結(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)這些蛋白與PsGK41-57aa有互作關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)有待于通過(guò)優(yōu)化蛋白表達(dá)量、蛋白表達(dá)的完整性或使用其他互作分析方法等進(jìn)一步驗(yàn)證。其他篩選到的候選互作蛋白也有待進(jìn)一步分析驗(yàn)證。
　　通過(guò)大豆疫霉PsIMPA1基因沉默突變體的轉(zhuǎn)錄組分析篩選可能與無(wú)性繁殖相關(guān)的基因。親核蛋白是真核細(xì)胞中十分保守的一類(lèi)

8、蛋白質(zhì)家族，負(fù)責(zé)細(xì)胞中的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，即將細(xì)胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中，從而調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，或?qū)⑥D(zhuǎn)錄的mRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中進(jìn)行蛋白翻譯。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)PsIMPA1沉默后，突變體不能產(chǎn)生孢子囊及游動(dòng)孢子，且侵染大豆過(guò)程中不能有效清除活性氧，導(dǎo)致致病能力顯著下降。本研究利用RNA-seq探究了大豆疫霉PsIMPA1基因沉默突變體在菌絲階段和孢子囊階段中（與野生型相比）基因表達(dá)模式的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆疫霉PsIMPA1的