鏈霉菌分化負(fù)調(diào)節(jié)基因nsdA在抗生素高產(chǎn)育種上的應(yīng)用.pdf

1、nsdA是該實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)全局性負(fù)調(diào)控基因,對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌抗生素的合成和產(chǎn)孢形態(tài)分化具有負(fù)調(diào)節(jié)作用.nsdA的中斷菌株能夠提前且超量產(chǎn)生放線紫紅素、鈣依賴(lài)抗生素、次甲基霉素,同時(shí)產(chǎn)孢量也增多.該研究的目的是研究nsdA基因在其它鏈霉菌特別是重要抗生素產(chǎn)生菌中是否廣泛存在,并用于構(gòu)建抗生素高產(chǎn)菌株.在該論文中,用天藍(lán)色鏈霉菌nsdA片斷為探針進(jìn)行Southern雜交,在阿維鏈霉菌NRRL8165、吸水鏈霉菌5008、白色鏈霉菌JA3

2、453、金色鏈霉菌211、變鉛青鏈霉菌ZX64、鏈霉菌FR-008 DX600、吸水鏈霉菌10-22等7種鏈霉菌中都有雜交信號(hào);并且PCR擴(kuò)增都有明顯的特征帶.表明這些菌株中都含有nsdA的同源基因.變鉛青鏈霉菌含有沉默的放線紫紅素生物合成基因簇.對(duì)ZX64菌株的nsdA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定,結(jié)果表明該基因與天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)的nsdA有100﹪的核苷酸序列一致性.用基于同源重組的原理中斷ZX64的nsdA,抗性篩選獲得中斷菌株

3、WQ2,PCR實(shí)驗(yàn)從分子水平上證明WQ2染色體中的nsdA已被中斷.與沉默的野生型菌株ZX64相比,WQ2能夠合成放線紫紅素;在WQ2中引入野生型nsdA,使互補(bǔ)菌株重新失去產(chǎn)抗生素能力.結(jié)果表明nsdA對(duì)變鉛青鏈霉菌抗生素合成具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,中斷nsdA能激活沉默的抗生素生物合成基因.根據(jù)已測(cè)序的阿維鏈霉菌MA-4680菌株的序列設(shè)計(jì)引物,從阿維鏈霉菌NRRL8165中PCR擴(kuò)增出包括nsdA同源基因nsdA<,av>及其兩側(cè)序列的5

4、.7kb的片段并測(cè)序驗(yàn)證.接著構(gòu)建了nsdA<,av>的中斷質(zhì)粒pHL214,把該質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移到阿維鏈霉菌NRRL8165中,篩選得到中斷菌株WQ5-1和WQ5-2,PCR驗(yàn)證中斷菌株中nsdA<,av>基因已被正確中斷.對(duì)中斷菌株的發(fā)酵產(chǎn)物HPLC的分析表明中斷菌株阿維菌素的效價(jià)提高了大約3~5倍.根據(jù)天藍(lán)色鏈霉菌的序列設(shè)計(jì)引物,從吸水鏈霉菌5008中PCR擴(kuò)增出包括nsdA同源基因nsdA<,jg>及其兩側(cè)序列的4.7kb的片段并測(cè)