兩種暖季型草坪草耐鹽基因的挖掘以及功能解析.pdf

1、狗牙根（Cynodon dactylon）和海濱雀稗(Paspalum vaginatum)是兩種重要的多年生暖季型草坪草。狗牙根生長(zhǎng)速度快，耐旱性、耐熱性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)的草坪綠化，但其耐鹽性較差，難以應(yīng)用到土壤鹽漬化嚴(yán)重的地區(qū)，挖掘狗牙根中與鹽脅迫相關(guān)的基因?qū)μ岣吖费栏哪望}性具有重要意義。海濱雀稗是一種鹽生草坪草，是能夠用于沿海灘涂和鹽堿地綠化改良的優(yōu)良草種，然而其耐鹽分子機(jī)制尚不清楚，挖掘海濱雀稗與鹽脅迫相關(guān)的

2、基因，有助于解析其耐鹽分子機(jī)制。本研究通過對(duì)兩種草坪草耐鹽相關(guān)基因的挖掘及功能解析，為進(jìn)一步探討草坪草的耐鹽調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，對(duì)草坪草的耐鹽育種具有實(shí)際的參考價(jià)值。
　　本研究首先以從狗牙根EST數(shù)據(jù)庫(kù)篩選并克隆的11個(gè)鋅指蛋白基因中的兩個(gè)CCCH家族基因CdZFP3和CdZFP7為對(duì)象，通過基因序列分析、非生物脅迫下表達(dá)特性分析，以及轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性檢測(cè)，初步探討了這兩個(gè)CCCH基因調(diào)控模式植物耐鹽性的生理機(jī)制;另外，本研

3、究還以海濱雀稗為材料，通過構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)結(jié)合酵母表達(dá)文庫(kù)篩選系統(tǒng)，挖掘出了18個(gè)與耐鹽性相關(guān)的候選基因。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)通過序列分析發(fā)現(xiàn)CdZFP3基因序列全長(zhǎng)1727bp，開放閱讀框1326bp，編碼442個(gè)氨基酸，與水稻OsC3H63_Os11g28270基因的親緣關(guān)系較近;CdZFP7基因序列全長(zhǎng)1206bp，開放閱讀框963bp，編碼321個(gè)氨基酸，與水稻的OsC3H25_Os03g61110具有較高的

4、親緣關(guān)系。通過對(duì)CdZFP3、CdZFP7基因在非生物脅迫下的表達(dá)特性分析發(fā)現(xiàn)CdZFP3基因受鹽脅迫、低溫以及ABA的誘導(dǎo)表達(dá);CdZFP7基因受鹽脅迫以及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　(2)構(gòu)建CdZFP3、CdZFP7基因的植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將這兩基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥，分別獲得5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子萌發(fā)率、可溶性糖含量、脯氨酸含量及光合特性比野生型都有提高，其電

5、解質(zhì)滲透率、活性氧含量低于野生型擬南芥，說明狗牙根CCCH型鋅指蛋白基因CdZFP3、CdZFP7對(duì)擬南芥的耐鹽性具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　(3) qRT-PCR分析鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥與鹽脅迫相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CdZFP3基因能夠調(diào)控?cái)M南芥AtSOS1、AtP5CS、AtSOD、AtPOD等基因的上調(diào)表達(dá)，CdZFP7基因能夠上諷AtNHX1、AtAKT1、AtP5CS、AtAPX1、AtSOD、AtPOD等基因的表達(dá)量，說明

6、CdZFP3、CdZFP7基因能夠通過調(diào)控抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)等多個(gè)途徑來增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性。
　　(4)采用CAP捕獲方法和Gateway重組構(gòu)建了高質(zhì)量的海濱雀稗全長(zhǎng)cDNA入門文庫(kù)以及酵母表達(dá)文庫(kù)，并通過酵母表達(dá)篩選體系，獲得了18個(gè)耐鹽候選基因，通過構(gòu)建表達(dá)載體和再次轉(zhuǎn)化驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，這18個(gè)基因能夠提高酵母細(xì)胞的耐鹽性。
　　(5)對(duì)18個(gè)耐鹽候選基因分析發(fā)現(xiàn)，涉及光合代謝(psaK、Cha/b、Elip)、抗氧化系統(tǒng)