γ-GCS-GS(谷胱甘肽合成酶)在原核和真核細胞中的表達和重金屬耐受性研究.pdf

1、谷胱甘肽(GSH)是普遍存在于植物、動物和其它生物體內的活性三肽。分子結構中的活性巰基具有重要的生物學功能,使其能絡合金屬離子,降低重金屬對細胞的毒害。且其作為一種抗氧化劑,能夠清除重金屬毒性產(chǎn)生的活性氧自由基。所以,提高GSH的含量能夠提高生物體對重金屬的耐受性。GSH是由谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)催化合成,但γ-GCS的催化活性受產(chǎn)物GSH的反饋抑制,使得細胞內GSH含量維持在一定水平。根據(jù)文獻報道,

2、在某些革蘭氏陽性菌中存在一種具有γ-GCS和GS兩種活性的雙功能融合蛋白γ-GCS-GS,研究發(fā)現(xiàn)該酶不受GSH的反饋抑制。所以該酶的表達能夠使細胞合成大量的GSH。
　　 本研究中,通過一系列生物信息學網(wǎng)站及軟件對嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)StGCS-GS基因編碼的γ-GCS-GS進行預測分析表明,該蛋白分子量為85.1kD,理論等電點為4.90,平均疏水值為-0.268。該蛋白含有一個ATP結合位點,且具有G

3、lu cys ligase和CPSase L D2亞家族保守域。同源比對發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌γ-GCS-GS的氨基酸序列與唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)和無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)γ-GCS.GS序列的相似性分別為93％、73％和63％。進化樹分析表明它們的親緣關系也相對較近。蛋白質三維結構預測表明它們的γ-GCS-

4、GS具有相似的空間構架,推測其行使相似的功能。
　　 為了研究StGCS-GS基因在原核系統(tǒng)中的表達情況及其在重金屬脅迫下的抗性功能,本實驗將含有重組質粒pETG-10A+GCS-GS的大腸桿菌通過IPTG誘導,經(jīng)Ni2+-NTA親核層析柱純化后獲得了高純度的融合蛋白。經(jīng)Western blot檢測,純化后的蛋白為His-γ-GCS-GS融合蛋白。對轉化大腸桿菌進行不同濃度Cd2+、Ni2+、Cu2+脅迫的耐受性測試。結果發(fā)現(xiàn),

5、在1mM CdCl2、2mM NiSO4脅迫條件下,轉化大腸桿菌的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于對照,但在Cu2+脅迫條件下,兩者沒有明顯區(qū)別。表明StGCS-GS基因的表達能夠提高大腸桿菌對Cd、Ni的抗性,在其逆境脅迫下的生長發(fā)揮重要作用。
　　 為了進一步研究StGCS-GS基因是否賦予轉基因酵母在不同非生物脅迫下的抗性功能及其在酵母細胞中的表達定位情況,實驗將StGCS-GS基因構建到酵母表達載體pYES2上,并轉化到釀酒酵母(Sac

6、charomyces cerevisiae)INCSc1菌株中。檢測轉基因酵母在不同脅迫培養(yǎng)基上的存活率。結果表明:在不同濃度的CdCl2、NiSO4及H2O2脅迫下,轉StGCS-GS基因的酵母的生長狀態(tài)要好于對照。在CdCl2脅迫下表現(xiàn)的耐性更加明顯。但在CuCl2和Sorbitol脅迫下,并未表現(xiàn)出耐受性。這說明StGCS-GS基因的表達使得轉基因酵母具有抗Cd、Ni及氧化脅迫的能力。此外,利用γ-GCS-GS-GFP融合蛋白對目

7、的蛋白進行了表達定位研究,結果表明融合蛋白定位于酵母的細胞質中。
　　 為了進一步研究StGCS-GS基因的表達是否能提高高等植物的在重金屬脅迫下的耐受能力。實驗對9個相互獨立并穩(wěn)定表達γ-GCS-GS的轉基因煙草T3代株系進行了重金屬脅迫耐受性分析。通過對野生型和轉基因煙草在Cd、Ni、Cn脅迫后的根長、鮮重及葉綠素的統(tǒng)計分析表明,在不同濃度的Cd2+和Ni2+脅迫下,轉基因煙草的生長狀態(tài)都要優(yōu)于野生型。但在Cu2+脅迫下,轉