阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外促肝星狀細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)研究阿魏酸(Ferulic acid，F(xiàn)A)聯(lián)用大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells，ADMSCs)對(duì)活化大鼠肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）凋亡的影響。進(jìn)一步探討兩者協(xié)同促HSCs凋亡作用機(jī)制，是否通過(guò)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的TGF-β/Smad信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　方法：1、FA最佳藥物作用濃度的確定：①用完全培養(yǎng)基將HSCs

2、培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)60％-70％時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)6h、12h、24h、36h、48h，用四甲基偶氮哇藍(lán)(MTT)法測(cè)HSCs的OD值，繪制HSCs生長(zhǎng)曲線并確定最適細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。②用完全培養(yǎng)基將HSCs培養(yǎng)至細(xì)胞密度約60％-70％時(shí)，換用含不同濃度（25-800μg/mL）FA的無(wú)血清培養(yǎng)基處理HSCs，用MTT法測(cè)HSCs的細(xì)胞增殖抑制率，并計(jì)算IC50，確定FA的最佳藥物作用濃度。③用完全培養(yǎng)基將ADMSCs培養(yǎng)至細(xì)胞密

3、度達(dá)60％-70％時(shí)，換為無(wú)血清培養(yǎng)，用MTT法檢測(cè)FA對(duì)ADMSCs的存活率的影響。2、實(shí)驗(yàn)分組：利用Transwell半透膜對(duì)ADMSCs和HSCs以1∶5的比例建立上下層間接共培養(yǎng)體系，當(dāng)兩者細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中達(dá)到60％-70％密度時(shí)，換為無(wú)血清培養(yǎng)，然后將HSCs分為4組：①空白對(duì)照組：HSCs單獨(dú)培養(yǎng)，不加FA和ADMSCs;②FA條件對(duì)照組：加入FA處理HSCs;③ADMSCs條件對(duì)照組：加入ADMSCs，用Transwel

4、l建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系。ADMSCs在上層Transwell中培養(yǎng)，HSCs在下層6孔板中培養(yǎng);④A/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組：在ADMSCs與HSCs共培養(yǎng)體系中加入FA共同作用。3、阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞凋亡的影響：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HSCs的凋亡率;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組HSCs上清液中CollagenⅠ的含量。4、阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促肝星狀細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞相關(guān)TGF-β/Smad通路研究

5、：利用qRT-PCR檢測(cè)各組HSCs中TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7mRNA的表達(dá)水平;Western blot檢測(cè)各組HSCs中TGF-β1和Smad7蛋白、Smad2/3磷酸化(p-Smad2/3)表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1、MTT結(jié)果顯示：本實(shí)驗(yàn)換為無(wú)血清條件后的最適細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為24h;不同濃度FA作用24h后，與未加FA的對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組HSCs生長(zhǎng)抑制率均顯著升高(P＜0.05)。用SPSS22.0軟

6、件中文版計(jì)算出IC50=243μg/mL。結(jié)合本課題前期實(shí)驗(yàn)，確定FA的最終藥物處理濃度為200μg/mL;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此濃度的FA對(duì)ADMSCs的存活率影響不明顯2、流式細(xì)胞儀測(cè)HSCs凋亡率結(jié)果示：與空白對(duì)照組比較，ADMSCs組中HSCs凋亡率變化無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;FA組、FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組HSCs的凋亡率均明顯增高(P＜0.05)。與兩條件對(duì)照組比較，F(xiàn)A/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組中HSCs的凋亡率均顯著升高(P＜0.05

7、)。ELISA結(jié)果顯示：在無(wú)血清條件下，各組HSCs培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)上清液中的CollagenⅠ的濃度出現(xiàn)了差異。與空白對(duì)照組組比較，ADMSCs組中CollagenⅠ的濃度變化無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：FA組、FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組HSCs的CollagenⅠ濃度均顯著降低(P＜0.001)。與FA組和ADMSCs組兩條件對(duì)照組比較，F(xiàn)A/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組上清中的CollagenⅠ含量顯著降低(P＜0.05或P＜0.001）。3、qRT

8、-PCR和Western blot檢測(cè)對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路結(jié)果顯示：與空白和條件對(duì)照組比較：FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組中HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA表達(dá)明顯下降，Smad7mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05或P＜0.01);FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組中HSCs的TGF-β1蛋白表達(dá)、Smad2/3磷酸化水平顯著降低，而Smad7蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：阿魏酸聯(lián)