狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽經(jīng)TGF-β1-AKT-RUNX2-SIRT6通路對(duì)人成骨細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　復(fù)制糖皮質(zhì)激素-地塞米松（DXM）誘導(dǎo)的人成骨細(xì)胞（Saos-2）體外損傷模型，證明狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽（CPWPS）經(jīng)TGF-β1/AKT/RUNX2/SIRT6信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的保護(hù)作用；并確認(rèn)小分子肽Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的生物活性。
　　方法：
　　以Saos-2細(xì)胞作為研究對(duì)象，CCK-8技術(shù)篩選DXM的最佳造模濃度，檢測(cè)CPWPS對(duì)Saos-2細(xì)胞的毒性。實(shí)驗(yàn)分組：正常組、DXM

2、組、陽(yáng)性對(duì)照組（1.0×10-5 M RU-486）、DXM+CPWPS(100、200、400μg/mL)組、TGF-β1組、SC79組、Control siRNA組、Runx2-siRNA組。利用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)DXM作用于Saos-2細(xì)胞12、24、36、48、64h后，TGF-β1、AKT、Runx2、Sirt6 mRNA蛋白經(jīng)時(shí)表達(dá)變化，及不同處理組中AKT的磷酸化水平和TGF-β1、AKT、Ru

3、nx2、Sirt6的表達(dá)變化，并運(yùn)用特異性激活劑、siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)證明其級(jí)聯(lián)關(guān)系。建立高效液相色譜法檢測(cè)各組細(xì)胞外液中Pro-Hyp、Gly-Pro-Hyp含量，以確定成骨細(xì)胞對(duì)CPWPS的代謝能力，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。
　　結(jié)果：
　　CCK-8結(jié)果顯示，1.0×10-5 M的DMX處理成骨細(xì)胞48h后，細(xì)胞存活率下降（P＜0.01）；100、200、400μg/mL CPWPS作用48h，可顯著

4、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖（P＜0.05），10000μg/mL時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞毒性；與模型組相比，CPWPS預(yù)保護(hù)48h可劑量依賴性地升高細(xì)胞存活率（P＜0.05）。經(jīng)時(shí)表達(dá)變化結(jié)果顯示，較之正常組，DXM作用于Saos-2后，TGF-β1mRNA及蛋白分別在48和60h時(shí)表達(dá)水平最低；Akt mRNA及蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異，而其磷酸化水平在48h時(shí)最低；Runx2 mRNA與蛋白表達(dá)趨勢(shì)先升高后降低，60h時(shí)表達(dá)水平最低；Sirt6 mRNA

5、及蛋白表達(dá)水平均呈時(shí)間依賴性地下降，分別在48h和60h時(shí)達(dá)到低谷（P＜0.05）。較之模型組，0.5 ng/mLTGF-β1作用12h后，AKT表達(dá)水平不變，但是p-AKT/AKT升高（P＜0.05），提示TGF-β1調(diào)控AKT磷酸化；5μM的SC79預(yù)處理Saos-2細(xì)胞2h后，Runx2與Sirt6蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），提示Runx2、Sirt6受到AKT的調(diào)節(jié)；Si-Runx2轉(zhuǎn)染6h后Sirt6蛋白表達(dá)量下降（P＜

6、0.05），提示Sirt6是Runx2的下游，綜上表明在DXM誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷過(guò)程存在TGF-β1/AKT/Runx2/Sirt6通路的調(diào)控。CPWPS孵育48 h后，TGF-β1、Runx2、Sirt6 mRNA及蛋白表達(dá)水平較模型組升高，AKT mRNA及蛋白表達(dá)水平不變，但p-AKT/AKT上升（P＜0.05）。與模型組相比，CPWPS+TGF-β1共孵育能夠上調(diào)p-AKT/AKT的表達(dá)（P＜0.05）；SC79+CPWPS共孵

7、育使Runx2和Sirt6表達(dá)水平升高（P＜0.05），相對(duì)于SC79單獨(dú)處理組，SC79+CPWPS組Runx2蛋白表達(dá)上調(diào)，但無(wú)顯著性差異；Runx2-siRNA+CPWPS組Sirt6蛋白表達(dá)水平較Runx2-siRNA組升高，說(shuō)明CPWPS可調(diào)控Runx2/Sirt6；以上研究表明CPWPS可能是通過(guò)正向調(diào)控TGF-β1/AKT/Runx2/Sirt6通路拮抗DXM誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷。HPLC結(jié)果表明，Gly-Pro-Hyp線性

8、關(guān)系式為y=2E+07x，R2=0.9984、Pro-Hyp線性關(guān)系式為y=3E+07x，R2=0.9987，線性關(guān)系良好；低、中、高濃度的Gly-Pro-Hyp的平均回收率分別為96.39%、99.56%和98.94%，RSD分別為0.91%、2.86%和1.73%，Pro-Hyp的平均回收率分別為96.83%、99.90%和99.27%，RSD分別為2.15%、3.02%、2.62%，提示小分子肽的加樣回收率良好。與正常組比，模型組

9、中Pro-Hyp含量顯著降低（P＜0.05），0.25、0.5、1.0 mg/mLCPWPS組以及0.4 mg/mL的三肽組中Gly-Pro-Hyp、Pro-Hyp的含量較模型組均升高（P＜0.05），提示成骨細(xì)胞可將CPWPS代謝為小分子短肽。
　　結(jié)論：
　　1.0×10-5 M的DMX可成功復(fù)制成骨細(xì)胞損傷模型，DXM能夠誘導(dǎo)Sirt6的低表達(dá)，CPWPS可能通過(guò)上調(diào)TGF-β1/AKT/Runx2/Sirt6通路，拮