湘瓊兩地蝙蝠攜帶星狀病毒與諾如病毒的調(diào)查研究.pdf

1、研究背景和目的:研究表明,蝙蝠是多種人獸共患疾病病毒的自然宿主,并可以跨越物種間屏障,將病毒傳播給人類(lèi)和其他動(dòng)物。目前研究人員已經(jīng)從蝙蝠身上發(fā)現(xiàn)或分離很多種病毒,約有18個(gè)病毒科包含70多種病毒。已知能從蝙蝠傳播給人類(lèi)的病毒主要有狂犬病毒、尼巴病毒、亨德拉病毒,還有類(lèi)SARS冠狀病毒,這些病毒都可以引起人類(lèi)致命性的疾病。其他病毒,如甲病毒屬、黃病毒屬和布尼亞病毒屬病毒可通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物傳播給蝙蝠,但還不確定蝙蝠是不是這類(lèi)病毒所致疾病的播散宿

2、主?？梢?jiàn),還需要大量研究,以明確蝙蝠在病毒性自然疫源性疾病中所扮演的角色。
　　 我國(guó)約有120種蝙蝠,但國(guó)內(nèi)對(duì)蝙蝠的研究工作起步較晚,對(duì)其生態(tài)學(xué)、行為學(xué)研究尚不夠深入,尤其是對(duì)我國(guó)蝙蝠攜帶哪些種類(lèi)病毒,以及病毒與蝙蝠生態(tài)學(xué)的關(guān)系,對(duì)人類(lèi)健康的影啊的研究還較少。迄今為止,我國(guó)科研工作者對(duì)蝙蝠所攜帶病毒的研究有以下發(fā)現(xiàn):從蝙蝠體內(nèi)分離到羅斯河病毒、乙型腦炎病毒、基孔肯雅病毒、森林腦炎病毒、SARS類(lèi)冠狀病毒、狂犬病病毒、星狀病毒、

3、尼巴病毒等。這些發(fā)現(xiàn)表明我國(guó)蝙蝠可攜帶某些我國(guó)常見(jiàn)傳染病的病毒。
　　 病毒性胃腸炎(viral gastroenteritis)又稱病毒性腹瀉,是一組由多種病毒引起的急性腸道傳染病。臨床特點(diǎn)為起病急、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉,排水樣便或稀便,也可有發(fā)熱及全身不適等癥狀,病程短,病死率低。病毒性腹瀉在兒童中更是一種常見(jiàn)病和多發(fā)病,是導(dǎo)致兒童死亡的重要原因。引起兒童腹瀉的病毒主要有輪狀病毒(rotavirus)、腸道腺病毒(aden

4、ovirus)、星狀病毒(astrovirus,Astv)、諾如病毒(norovirus,NoV)等。
　　 患者與無(wú)癥狀帶毒者是病毒性胃腸炎的主要傳染源。糞-口途徑傳播是病毒性胃腸炎最重要的傳播途徑,少部分可以通過(guò)空氣傳播,其可通過(guò)被污染的食物或水引起人群胃腸炎暴發(fā)或散發(fā)?；仡櫳鲜兰o(jì)90年代的亨德拉病毒和尼帕病毒的暴發(fā)事件,也是源于食源性感染,是由于蝙蝠病毒污染了水域、水果,再依次傳播給馬、豬、人,最后導(dǎo)致疾病暴發(fā)。
　

5、　 星狀病毒(Astrovirus,Astv)于1975年在胃腸炎患兒糞便標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn),由于電鏡下病毒顆粒呈星形,因此被命名為星狀病毒。此后世界各地均已有星狀病毒感染的報(bào)道,它既可散發(fā)也可以引起暴發(fā)流行,亦可引起醫(yī)源性感染。住院腹瀉患兒中星狀病毒檢出率為2.5％～9.0％,目前認(rèn)為星狀病毒是嬰幼兒病毒性胃腸炎的第二位病因,僅次于輪狀病毒。
　　 星狀病毒既可感染人,也可感染牛、羊、豬、狗、鹿、火雞、鴨、鼠等多種動(dòng)物,導(dǎo)致不同

6、程度的胃腸炎。人群感染的星狀病毒,傳統(tǒng)上可分為8個(gè)血清型。最近,研究者又在腹瀉病人中發(fā)現(xiàn)兩種的新星狀病毒,astrovirus MLB和astrovirus VA。研究還發(fā)現(xiàn),Astv MLB1與新近發(fā)現(xiàn)的鼠星狀病毒很相近；Astv VA1在進(jìn)化樹(shù)上與感染羊和貂的星狀病毒最為接近。這提示新發(fā)現(xiàn)的人星狀病毒可能和動(dòng)物的星狀病毒存在一定的關(guān)系。
　　 近年來(lái),香港大學(xué)研究小組分別從香港和中國(guó)大陸的蝙蝠體內(nèi)檢出星狀病毒,檢出率高達(dá)46

7、％和44.8％；基因分析顯示蝙蝠星狀病毒具有高度基因多態(tài)性,部分病毒可能與感染人的星狀病毒有系統(tǒng)進(jìn)化的關(guān)系。然而關(guān)于蝙蝠星狀病毒的生態(tài)學(xué)資料還很稀少,有必要進(jìn)一步擴(kuò)充不同地區(qū)和不同種類(lèi)的蝙蝠樣本進(jìn)行研究。
　　 諾如病毒(Norovirus,NoV)是一組杯狀病毒屬病毒,其原型株諾瓦克病毒于1972年在美國(guó)諾瓦克市被分離發(fā)現(xiàn)。由于該組病毒極易變異,此后在其他地區(qū)又相繼發(fā)現(xiàn)并命名了多種類(lèi)似病毒,統(tǒng)稱為諾如病毒。NoV是一種高致病的

8、、傳染性極強(qiáng)的腸胃病毒,能導(dǎo)致急性胃腸炎,一旦有人感染,通常會(huì)發(fā)展為群體性的大規(guī)模傳染。遺憾的是,由于病毒的高度變異性及其缺少合適的動(dòng)物研究模型,現(xiàn)今還未研發(fā)出理想的NoV疫苗,患者容易發(fā)生反復(fù)感染。
　　 自然界中攜帶NoV的物種很多,包括有人、豬、牛、鼠、海獅等,可導(dǎo)致它們發(fā)生不同程度的癥狀。根據(jù)基因特征,NoV被分為五個(gè)遺傳群(Gene Group,GG):GGⅠ、GGⅡ、GGⅢ、GGⅣ和GGⅤ。五個(gè)遺傳群中,GGⅠ、GG

9、Ⅱ和GGⅣ主要感染人類(lèi),GGⅢ感染牛,GGⅤ則在鼠類(lèi)動(dòng)物內(nèi)檢出。
　　 雖然研究已表明NoV在多種動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在,但是關(guān)于動(dòng)物NoV感染的流行病學(xué)還不太清楚。動(dòng)物NoV在動(dòng)物體內(nèi)感染率差別較大,研究發(fā)現(xiàn)北美的實(shí)驗(yàn)鼠鼠類(lèi)NoV的感染率高達(dá)22.1％,英國(guó)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牛的腹瀉病例中有11％比例為NoV感染所致,而豬NoV檢出率比較低,在日本豬GGⅡ NoV的檢測(cè)率僅為0.35％,在荷蘭檢測(cè)率為2.0％。
　　 盡管現(xiàn)今沒(méi)有證據(jù)

10、表明動(dòng)物NoV可以感染人類(lèi),但是分子生物學(xué)分析表明動(dòng)物NoV和人類(lèi)NoV的毒株相互之間有密切的關(guān)系,尤其是豬NoV的毒株可被歸入到與人類(lèi)NoV毒株相同的基因群(GGⅡ)。新近研究發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)普遍存在人NoV的抗體,這進(jìn)一步加強(qiáng)了動(dòng)物可能充當(dāng)著人類(lèi)NoV儲(chǔ)存庫(kù)的假設(shè)。此外,研究還發(fā)現(xiàn)貝殼類(lèi)動(dòng)物可同時(shí)攜帶人類(lèi)NoV和動(dòng)物NoV,這提示一種新的基因重組株可能出現(xiàn)。最近,在加拿大人們檢測(cè)到豬NoV和牛NoV的序列與入NoVGGⅡ.4毒株的序列非常

11、接近。因此,將來(lái)或許要重新評(píng)估NoV種間傳播的可能性及其人畜共患的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 2009年,武漢病毒研究所在蝙蝠體內(nèi)檢測(cè)到另一種導(dǎo)致人腹瀉的病毒-腸道腺病毒,檢出率為8％(28/350),基因分析顯示蝙蝠腺病毒亦具有高度基因多樣性,這提示蝙蝠可能有攜帶一系列高變異病毒的能力。研究已經(jīng)在蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了星狀病毒和腺病毒兩種腹瀉相關(guān)病毒,關(guān)于蝙蝠是否攜帶有NoV,暫未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,因而我們不禁疑問(wèn)蝙蝠是否攜帶有可導(dǎo)致爆發(fā)流行的NoV。

12、鑒于NoV的高度基因變異性和多宿主性,作為種類(lèi)第二多的哺乳動(dòng)物(1000多種)—蝙蝠也很有可能攜帶此類(lèi)病毒,甚至可能是它們的宿主。
　　 因此,為進(jìn)一步了解不同地區(qū)不同種類(lèi)蝙蝠攜帶星狀病毒的本底情況,探討其與感染人星狀病毒的關(guān)系,同時(shí)了解這些地區(qū)的蝙蝠是否攜帶諾如病毒,本研究擬在先前未見(jiàn)報(bào)道的湖南、海南部分地區(qū)為現(xiàn)場(chǎng),對(duì)當(dāng)?shù)仳饠y帶星狀病毒和諾如病毒情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。
　　 研究方法
　　 1.樣本的采集和處

13、理2007年7月至2008年7月,于岳陽(yáng)、邵陽(yáng)、?？谌貐^(qū)蝙蝠長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)點(diǎn)中選取4個(gè)蝙蝠自然棲息地,現(xiàn)場(chǎng)捕捉蝙蝠,進(jìn)行編號(hào)后,請(qǐng)蝙蝠研究專家進(jìn)行鑒定。標(biāo)本采集方式分兩種,分別為采集肛拭子和剪取直腸組織。采集的樣本存放于含200μl RNAlater儲(chǔ)存液的凍存管中,置放于密封的冰袋泡沫盒中當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,放于-80℃冰箱貯存,待檢。
　　 2.蝙蝠病毒的檢測(cè)與鑒定
　　 2.1.星狀病毒
　　 ①半巢式PCR篩檢樣

14、本參照文獻(xiàn),針對(duì)星狀病毒高度保守的RdRp基因,設(shè)計(jì)合成5條用于巢式PCR的引物,包括4條前引物和1條共同的后引物,應(yīng)用巢式PCR方法檢測(cè)標(biāo)本。
　　 ②序列鑒定與分析對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠、純化和回收,然后送樣至公司測(cè)序。如遇陽(yáng)性PCR產(chǎn)物條帶很弱者,則先做克隆,再取接種培養(yǎng)后菌液送樣至公司測(cè)序鑒定。
　　 ③將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入GenBank的BLAST軟件進(jìn)行在線同源性分析,然后在GenBank下載相關(guān)核酸序列,利用C

15、lastal X軟件對(duì)所要分析的序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析,并用DNAstar軟件對(duì)核酸序列相似性進(jìn)行計(jì)算。使用MEGA4.1軟件,用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。
　　 2.2.諾如病毒
　　 ①TaqMan real-time PCR檢測(cè)基因組Ⅱ型諾如病毒(GGⅡ NoV)參照文獻(xiàn)并合成用于檢測(cè)GGⅡ NoV公認(rèn)的特異引物和探針,利用TaqManreal-time PCR方法對(duì)本進(jìn)行檢測(cè)。

16、　　 ②SYBR Green real-time PCR檢測(cè)諾如病毒參照文獻(xiàn)合成可檢測(cè)NoV的兩對(duì)通用引物P289/P290和12Y/13I,應(yīng)用SYBR Green real-time PCR方法分別檢測(cè)標(biāo)本。
　　 ③GGV型NoV特異引物檢測(cè)標(biāo)本參照文獻(xiàn)合成公認(rèn)的可檢測(cè)GGV型NoV引物,應(yīng)用普通RT-PCR方法檢測(cè)標(biāo)本。
　　 ④對(duì)普通RT-PCR擴(kuò)增獲得的可疑陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠、純化和回收,然后送樣至公司

17、測(cè)序。對(duì)TaqMan real-time PCR檢測(cè)的可疑陽(yáng)性PCR產(chǎn)物,送樣至公司克隆鑒定。
　　 3.質(zhì)量控制
　　 ①移液槍頭、凍存管、EP管等實(shí)驗(yàn)耗材均為一次性用品。
　　 ②RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)所采用的所有容器和配制試劑用DEPC水處理,高溫高壓處理,烘干待用,以去除RNA酶污染。
　　 ③全程戴口罩、手套、帽子,在無(wú)菌室生物安全柜進(jìn)行操作,防止試劑和實(shí)驗(yàn)過(guò)程受到污染。
　　 ④實(shí)驗(yàn)過(guò)

18、程嚴(yán)格設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。
　　 結(jié)果
　　 1.蝙蝠基本情況本次研究在湖南、海南兩省四個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)共采集蝙蝠321只,涉及2個(gè)蝙蝠亞目4個(gè)蝙蝠科9個(gè)種類(lèi)的蝙蝠。共制備蝙蝠糞便標(biāo)本321份,包括肛拭子59份和直腸樣本262份。
　　 2.星狀病毒的檢測(cè)
　　 ①巢式RT-PCR檢測(cè)到陽(yáng)性標(biāo)本29例,總陽(yáng)性率為9.03％(29/321),在9種表面健康的蝙蝠中發(fā)現(xiàn)有3種蝙蝠攜帶有星狀病毒,陽(yáng)性蝙蝠

19、種類(lèi)包括長(zhǎng)翼蝠(22/187)、小黃蝠(6/38)和棕果蝠(1/59),以小黃蝠的檢出率最高。
　　 ②以星狀病毒RdRp基因部分氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)分析顯示,本研究檢測(cè)的蝙蝠星狀病毒不僅與來(lái)源于其他種類(lèi)的星狀病毒差異較大,而且本身也有很大的差異。然而,有5個(gè)蝙蝠星狀病毒卻與羊星狀病毒(ovine Astv)、貂星狀病毒(mink Astv)和人新型星狀病毒Astv VA在進(jìn)化樹(shù)上最為相近,序列相似性為51.6％-63.1％。

20、另外,有8株從邵陽(yáng)地區(qū)同一個(gè)洞穴長(zhǎng)翼蝠檢測(cè)到的星狀病毒相聚在一小分支,它們的氨基酸序列相似性為97％-99％。
　　 3.諾如病毒的檢測(cè)本研究采用TaqMan real-time PCR、SYBR Green real-time PCR和普通RT-PCR三種實(shí)驗(yàn)方法,應(yīng)用多對(duì)引物分別篩查上述蝙蝠糞便樣本GGⅠ～Ⅳ型NoV攜帶情況,檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
　　 結(jié)論
　　 ①巢式PCR檢測(cè)到星狀病毒陽(yáng)性率為9.03％(

21、29/321),并首次在果蝠身上檢出星狀病毒(1/59),提示此類(lèi)星狀病毒可能適應(yīng)于翼手目動(dòng)物,盡管不同種類(lèi)的蝙蝠對(duì)它的易感程度不一。
　　 ②本研究檢出的蝙蝠星狀病毒基因多態(tài)性豐富,這結(jié)果與先前研究一致。5株蝙蝠星狀病毒卻與羊星狀病毒、貂星狀病毒、人星狀病毒AStv VA在進(jìn)化樹(shù)上最為相近,并具有較高的氨基酸序列相似性。這提示蝙蝠星狀病毒可能跨種族傳播給人類(lèi)或其他動(dòng)物,亦或是在它們之間相互傳播。
　　 ③來(lái)自邵陽(yáng)同一個(gè)