豬四倍體胚胎制作和4n-2N胚胎嵌合制作.pdf

1、嵌合體是由不同遺傳組成的細(xì)胞或者組織構(gòu)成的嵌合生物個體。通過電融合制作小鼠四倍體胚胎與二倍體胚胎或者ES細(xì)胞嵌合后，四倍體胚胎來源的細(xì)胞貢獻到胚外譜系中，二倍體細(xì)胞可以貢獻到胚內(nèi)和胚外譜系中，胚胎發(fā)育到期后能夠得到完全來自二倍體胚胎或者ES的個體，這種方法稱為四倍體補償技術(shù)。因此，四倍體補償技術(shù)可以繞過傳統(tǒng)二倍體嵌合小鼠階段，直接得到基因修飾的小鼠。除此之外，嵌合體的研究有助于胚胎細(xì)胞發(fā)育分化的研究和特殊物種基因保存，在動物育種、生產(chǎn)轉(zhuǎn)

2、基因動物研究、醫(yī)學(xué)、產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等眾多領(lǐng)域也都具有廣泛應(yīng)用價值。
　　 但關(guān)于豬嵌合體的研究鮮有報道，如何優(yōu)化豬四倍體胚胎的制作方法，二倍體胚胎與四倍體胚胎嵌合最佳時期的確定，以及嵌合后不同倍性來源的細(xì)胞在嵌合囊胚中時如何分布等，都沒有相關(guān)的報道，有待于研究。因此，為了探索豬的四倍體制作方法，四倍體嵌合體的制作方法，探索四倍體嵌合的生物學(xué)現(xiàn)象的觀察，為建立與豬相關(guān)的疾病模型和轉(zhuǎn)基因動物制作方法等奠定基礎(chǔ)，本研究進行豬四倍體和四倍體

3、嵌合的相關(guān)研究。
　　 1制作豬四倍體胚胎體系的優(yōu)化制作豬四倍體胚胎的最佳條件是90V,其融合率(82.33±6.13)、囊胚率(28.38±2.41)、胚胎死亡率(13.24±4.43)。
　　 2.豬四倍體胚胎的發(fā)育時程和囊胚質(zhì)量檢測觀察胚胎發(fā)育時程，發(fā)現(xiàn)四倍體在發(fā)育早期稍晚于二倍體胚胎，但是發(fā)生致密化和囊胚形成時間相近,并且四倍體與二倍體的發(fā)育率接近無顯著差異，但4N囊胚細(xì)胞數(shù)(21.90±4.95)與2N囊胚細(xì)胞

4、數(shù)(45.34±5.00)差異顯著。
　　 3.熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測四倍體的倍性用熒光原位雜交技術(shù)檢測了胚胎的倍性，檢測融合后胚胎發(fā)育到囊胚時融合后發(fā)育的囊胚中68.18％為四倍體，27.27％為二倍體，4.5％為2N/4N嵌合胚胎。對照組二倍體囊胚中95％為二倍體，5％為2N/4N嵌合胚胎。
　　 4.2N-4N胚胎嵌合最佳聚合時期的探索4-Cell(4 N)＜-＞4-Cell(2 N）聚合方式的囊胚率(7

5、4.36％)、囊胚細(xì)胞數(shù)(67.10±15.39)顯著高于其它試驗組。
　　 5.2N-4N嵌合胚胎中不同倍性細(xì)胞分布特征4-Cell(4 N)＜-＞4-Cell(2 N)聚合20對，獲得12個囊胚，其中10個囊胚中2N胚胎細(xì)胞主要分布于ICM位置，少量分布于TE位置;另外2個囊胚中沒有出現(xiàn)任何的GFP信號，應(yīng)該是沒有嵌合成功。反試驗組中，聚合10對，發(fā)育得到5個囊胚，發(fā)現(xiàn)ICM外層和大部分的TE部位為4N胚胎來源細(xì)胞。

6、　　 6.四倍體胚胎與IPS細(xì)胞嵌合的研究夾心聚合法進行嵌合時，IPS細(xì)胞團與4N胚胎進行嵌合成功，囊胚率為62.5％，囊胚中IPS嵌合率為45％。顯微注射法制作嵌合胚胎，注射的IPS細(xì)胞成功嵌合到2N和4N囊胚中，2N囊胚中IPS嵌合率為21.54％，4N囊胚中IPS嵌合率為29.79％。
　　 綜上所述，本研究獲得了豬四倍體制作優(yōu)化體系，探索了四倍體與二倍體胚胎的嵌合和四倍體胚胎與IPS細(xì)胞的嵌合情況，為豬的四倍體胚胎和四