3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶在非酒精性脂肪性肝病中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　肝臟中脂肪酸的過度沉積會通過脂毒性導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfatty liver disease，NAFLD)的發(fā)生發(fā)展，但其中涉及的分子機(jī)制尚不明確。胱硫醚-β-合酶(cystahionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)是體內(nèi)內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)的主要產(chǎn)生酶，已被發(fā)現(xiàn)受到脂肪

2、酸的調(diào)控并參與NAFLD發(fā)病機(jī)制。本研究旨在探究另一內(nèi)源性H2S產(chǎn)生酶，3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)移硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST)在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。
　　材料和方法:
　　采用游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）（油酸∶棕櫚酸為2∶1）混合培養(yǎng)液刺激人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞，及高脂飲食（high fat diet，HFD）喂養(yǎng)C57BL/6小鼠

3、分別建立NAFLD細(xì)胞及動物模型，用Western Blot法檢測MPST在NAFLD模型中的表達(dá)水平。采用免疫組化法檢測MPST在NAFLD臨床患者肝臟標(biāo)本中的蛋白表達(dá)水平。采用重組腺病毒介導(dǎo)shRNA結(jié)合尾靜脈高壓注射技術(shù)對小鼠體內(nèi)肝臟MPST的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，并在借助轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nuclease，TALEN)技術(shù)構(gòu)建的C57BL/6為背景的MPS

4、T基因敲除雜合子小鼠中進(jìn)一步觀察MPST對肝臟脂肪變性的影響作用。在FFA刺激的L02細(xì)胞中，分別運用siRNA和轉(zhuǎn)染MPST過表達(dá)質(zhì)粒以干預(yù)MPST表達(dá)，觀察MPST對肝細(xì)胞脂肪變性的影響與作用。采用H&E及油紅O染色觀察肝臟和肝細(xì)胞脂變程度，通過測定肝甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量及FFA水平，聯(lián)系H2S水平變化，MDA及SOD活性等指標(biāo)變化研究MPST對肝臟脂肪變性及氧化應(yīng)激的影響。通過外源性H2S供體的應(yīng)用，檢測CSE及

5、SREBP-1通路、JNK磷酸化水平變化，免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，CoIP)技術(shù)探究潛在的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　FFA的刺激誘導(dǎo)MPST在人脂變肝細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并部分依賴于NF-κB/p65。在HFD誘導(dǎo)的小鼠NAFLD模型及臨床NAFLD患者肝臟中，MPST蛋白表達(dá)水平顯著升高。應(yīng)用MPST-shRNA重組腺病毒尾靜脈高壓注射介導(dǎo)小鼠肝臟MPST表達(dá)部分敲低，和使用MPST基因敲除

6、雜合子小鼠介導(dǎo)遺傳性的MPST表達(dá)部分缺失，均能顯著改善HFD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性程度。和體內(nèi)水平一致地，在L02細(xì)胞中抑制MPST表達(dá)后，F(xiàn)FA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂變顯著改善，而過表達(dá)MPST后則脂變加劇。有趣的是，部分敲低MPST會顯著上調(diào)H2S水平，相反地，過表達(dá)MPST則顯著下調(diào)H2S水平。CoIP實驗揭示MPST可以通過直接蛋白-蛋白相互作用而負(fù)調(diào)控CSE—肝臟中H2S產(chǎn)生主要酶。且進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，H2S在MPST對脂肪肝的調(diào)節(jié)