徐長(zhǎng)卿丹皮酚對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的影響.pdf

1、目的：骨性關(guān)節(jié)炎是骨科領(lǐng)域最常見的關(guān)節(jié)病變，隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的發(fā)展，OA的發(fā)病率會(huì)不斷升高，嚴(yán)重影響了中老年人的生活質(zhì)量。骨性關(guān)節(jié)炎的主要病理學(xué)變化為關(guān)節(jié)軟骨不同程度退行性變性或消失，以及軟骨下骨質(zhì)破壞。病理研究證實(shí)，關(guān)節(jié)軟骨軟骨變性是骨性關(guān)節(jié)炎特征性病理改變，也是OA最根基的病理改變。有關(guān)軟骨退變機(jī)制及其細(xì)胞和分子基礎(chǔ)成為近年來研究的熱點(diǎn)。本課題利用徐長(zhǎng)卿丹皮酚對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的影響作為切入點(diǎn)，從細(xì)胞形態(tài)、電鏡下超微病理結(jié)構(gòu)的改變、

2、分子生物學(xué)三個(gè)層面探討徐長(zhǎng)卿丹皮酚治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理，為臨床推廣徐長(zhǎng)卿丹皮酚治療骨性關(guān)節(jié)炎提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：40只體重2kg(±100g)健康新西蘭成年大耳白兔，雌雄不限，隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、生理鹽水組、曲安奈德組、徐長(zhǎng)卿丹皮酚組，每組8只。隨機(jī)選取8只作為正常組，其余32只采用兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板前1/3切除及前交叉韌帶切斷(ACLT)制備骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型方法[4]進(jìn)行造模，4周后造模成功。正常組:

3、不作任何治療。對(duì)照組:僅采用兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板前1/3切除及前交叉韌帶切斷(ACLT)制備骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型方法進(jìn)行造模，不予其它處理。生理鹽水組、曲安奈德組、徐長(zhǎng)卿丹皮酚組:造模術(shù)后第1周開始各組分別予以右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.9％生理鹽水、曲安奈德、徐長(zhǎng)卿丹皮酚各0.2ml，2次/周，共10次，給藥5周。各組動(dòng)物分別于完成5周用藥療程后，耳緣靜脈緩慢注入適量空氣處死，暴露膝關(guān)節(jié)腔。①關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察表面光滑度、色澤、表面糜爛程度、是否有

4、纖維性增生及軟骨下骨暴露等形態(tài)學(xué)改變，拍照并按大體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分;取制備好的股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，透射式電子顯微鏡下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察并拍照。②取右側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)面約2mm厚關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本制作成石蠟切片后，兩步法免疫組化染色，置光鏡下對(duì)其組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)的觀察，并參照Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行積分統(tǒng)計(jì)Mankin評(píng)分，包括關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)，細(xì)胞數(shù)的變化，潮線的完整性及易染性四個(gè)方面;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1）和其

5、抑制劑（TIMP-1）表達(dá)的陽性指數(shù)。③采用RNA原位雜交方法利用MMP-1和TIMP-1寡核苷酸探針，對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨MMP-1和TIMP-1 mRNA作定位和定量分析，檢測(cè)兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織MMP-1和TIMP-1 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.大體觀察示正常組關(guān)節(jié)面光滑完整。對(duì)照組軟骨改變集中在股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)面，關(guān)節(jié)軟骨有蟲蝕樣改變和軟骨剝脫缺損。生理鹽水組軟骨表面粗糙，肥厚。徐長(zhǎng)卿丹皮酚組關(guān)節(jié)面略粗

6、糙，軟骨輕度糜爛。曲安奈德組軟骨糜爛程度較徐長(zhǎng)卿組重，有的可見軟骨下骨暴露。電鏡觀察示正常組細(xì)胞形態(tài)正常，胞核完整，胞漿密度均勻，可見大量細(xì)胞器，細(xì)胞表面的絨毛和膠原清晰可見。對(duì)照組大多數(shù)軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器溶解，膠原排列紊亂。生理鹽水組大部分軟骨細(xì)胞腫脹明顯。徐長(zhǎng)卿組:細(xì)胞形態(tài)尚存，膠原輕度紊亂，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。曲安奈德組:呈顆粒狀外觀，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部分細(xì)胞器溶解，膠原纖維含量較少。
　　 2.組織學(xué)觀察示正常組

7、Mankin評(píng)分0-1分;徐長(zhǎng)卿丹皮酚組以輕度至中度損傷為主，Mankin評(píng)分4-6分;曲安奈德組以中等軟骨損傷為主，Mankin評(píng)分8-10分;造模組以重度軟骨損傷為主，Mankin評(píng)分11-12分;生理鹽水組與造模組相似。徐長(zhǎng)卿丹皮酚組軟骨組織MMP-1表達(dá)的陽性指數(shù)較正常組增高，較曲安奈德組和造模組低，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);徐長(zhǎng)卿丹皮酚組軟骨組織TIMP-1表達(dá)水平較曲安奈德組增高，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

8、0.05)，曲安奈德組TIMP-1表達(dá)水平與造模組、生理鹽水組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3.正常組關(guān)節(jié)軟骨MMP-1和TIMP-1 mRNA表達(dá)均低下或無表達(dá);徐長(zhǎng)卿丹皮酚組軟骨組織MMP-1和TIMP-1mRNA表達(dá)均較低;曲安奈德組軟骨組織MMP-1mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng);造模組關(guān)節(jié)軟骨MMP-1mRNA表達(dá)最強(qiáng)，TIMP-1mRNA全層無表達(dá)或低下;徐長(zhǎng)卿丹皮酚組軟骨組織MMP-1mRNA表達(dá)水平較正常組

9、增高，較曲安奈德組和造模組低，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);徐長(zhǎng)卿丹皮酚組軟骨組織TIMP-1 mRNA表達(dá)水平較曲安奈德組增高，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示關(guān)節(jié)損傷程度與MMP-1的表達(dá)成正相關(guān)，徐長(zhǎng)卿丹皮酚可能具有抑制MMP-1的表達(dá)，消除MMP-1對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)過度降解的作用。與此同時(shí)，MMP-1的特異性抑制物TIMP-1雖然隨著MMP-1分泌的升高也有所升高，但與MMP