孤對電子雜環(huán)類環(huán)境污染物的微生物降解研究.pdf

1、雜環(huán)化合物是指具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且除碳氫原子外，至少還含有一個雜原子的化合物。本文研究的對象主要是含有硫、氮、氧三類雜原子的孤對電子雜環(huán)化合物。這些雜環(huán)化合物是嚴重的污染源，化石燃料中的含硫、含氮化合物是在燃燒過程釋放出大量的硫氧化物和氮氧化物，是酸雨的成因之一，對環(huán)境造成了嚴重的污染。隨著人類社會的發(fā)展，能源的消耗與日俱增，這些化合物造成的污染也越來越嚴重。生物處理方法由于具有操作條件溫和、費用低、對環(huán)境造成的二次污染少而受到越來越多的

2、重視。二苯并噻吩(Dibenzothiophene，DBT)是化石燃料中含有的一種典型的有機硫化合物，使用傳統(tǒng)的加氫脫硫(Hydrodesulfurization，HDS)難以去除，因此選擇DBT作為微生物脫有機硫反應的模式化合物。石油中的含氮化合物主要是咔唑(Carbaz01e，CA)的各種烷基衍生物，所以生物脫氮的研究是以CA為模式化合物。二苯并呋喃(Dibenzofuran，DBF)是研究二惡英類(dioxin-1ike)氧雜環(huán)環(huán)

3、境污染物生物降解的模式化合物。 本工作使用實驗室前期分離出來的一株降解DBT的菌株XP為研究對象。菌株XP為常溫菌株，可以在30℃左右降解含硫化合物。對XP菌株進行了菌種鑒定，XP菌落生長初期形成短的分枝菌絲體，然后分化成球菌及棒桿菌的形態(tài)；菌落有光澤，從奶白色逐漸變?yōu)榉奂t色；XP菌株的分枝菌酸屬于紅球菌分枝菌酸；脂肪酸類型為無分支，含有飽和及不飽和脂肪酸，同時還含有結(jié)核菌脂酸，與數(shù)據(jù)庫中的紅平紅球菌脂肪酸類型有86.5％的同源

4、性；XP菌株的riboprint模式與模式菌株Rhodococcus erythropolis DSM 43066<'T>相似：XP菌株的16S rDNA序列在診斷區(qū)(1-500個堿基)與模式菌株Rhodococcus erythroliS DSM 43066<'T>的16S rDNA序列100％的同源。通過上述常規(guī)的形態(tài)學、化學分析法(包括脂肪酸、分枝菌酸分析)和分子生物學結(jié)果(Riboprint pattern和16S rDNA序列

5、的比對)，最終確定XP菌株屬于紅平紅球菌，命名為RhDdococcus erythroplis XP。 紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XP可以利用各種硫源，包括部分甲基噻吩、甲基苯并噻吩及全部測試的二苯并噻吩類化合物為唯一硫源生長。通過GC-MS分析，檢測了菌株XP代謝DBT的中間物及終產(chǎn)物。結(jié)果表明，菌株代謝DBT的終產(chǎn)物為2-羥基聯(lián)苯(2-Hydroxybiphenyl，2-HBP)，同

6、時檢測到了中間產(chǎn)物DBT砜(DBT sulfone，簡稱DBTO<,2>)。說明XP代謝DBT走經(jīng)典的硫?qū)Ｒ恍源x途徑，也稱為“4S”途徑。詳細考查了XP菌株對DBT在生長狀態(tài)下的降解情況和2-HBP的生成情況。發(fā)現(xiàn)XP可以在生長體系下，48h內(nèi)降解0.45mM的DBT同時生成0.42 mM的2-HBP，說明紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XP降解DBT與2-HBP的生成是對應的。同時分析了菌株XP對3-甲

7、基苯并噻吩(3-Methylbenzothiophene，3-MBT)和DBT烷基取代物，如4-甲基DBT(4-Methyl-DBT，4-MDBT)、4,6-二甲基DBT(4，6-DimethylDBT，4,6-DMDBT)和萘并苯噻吩(Benzonaphthothiophene，BNT)的代謝途徑。菌株XP代謝4-MDBT，生成了2-羥基-3’-甲基聯(lián)苯(2-hydroxy-3’-methylbiphenyl)和2-羥基-3-甲基聯(lián)苯

8、(2-hydroxy-3-methylbiphenyl) 代謝4,6-DMDBT生成了2-羥基-3，3’-二甲基聯(lián)苯(2-hydroxy-3，3’-dimethyl-biphenyl)；代謝BNT生成了α-羥基-β-苯基-萘(α-hydroxy-β-phenyl-naphthalene)。菌株XP對甲基苯并噻吩也有降解能力，代謝3-MBT生成2-異丙基苯酚(2-isopropenylphenol)。通過代謝途徑的分析發(fā)現(xiàn)，紅平紅球菌(

9、Rhodococcus erythropolis)XP降解噻吩類化合物走經(jīng)典的硫?qū)Ｒ恍酝緩剑上鄳牧u基苯/聯(lián)苯類化合物為終產(chǎn)物。 采用紅平紅球菌XP對柴油，原油和汽油進行了脫硫?qū)嶒灐＝Y(jié)果顯示XP菌株對初始硫含量為259 ppm的柴油可以達到94.5％的脫硫率，高于已摒道的生物脫硫率，達到了深度脫硫的目標。Rhodococcus erythropolis XP可以深度脫硫關(guān)鍵在于XP菌株可以更好的降解燃油中甲基化程度更高的含硫化

10、合物。經(jīng)生物脫硫催化劑作用后，柴油的烷烴沒有顯著的變化，說明該生物處理過程不損失燃燒值。同時首次報道XP菌株對原油有良好的處理效果，對初始硫含量為3,210 ppm的撫順原油有62.3％的脫硫率，對初始硫含量為1,237 ppm的蘇丹原油有47.2％的脫硫率，說明XP具有很大的應用潛力。依據(jù)當前中國原油開采的實際情況，提出了采用生物法處理原油要比處理柴油更有實際應用價值。本文還嘗試了使用XP休止細胞處理汽油，XP休止細胞可以脫除催化裂化

11、汽油中30％的硫；對直餾汽油處理效果明顯，可以達到85％的脫硫率。XP菌株對含硫量較高的催化裂化汽油處理效果不理想，XP更適用于以二苯并噻吩為主要含硫化合物的原油和柴油的生物脫硫。 根據(jù)已發(fā)表的脫硫基因序列的保守性，設計了引物，使用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增了紅平紅球菌XP的脫硫基因dszABC。得到的轉(zhuǎn)化子可以在24 h內(nèi)將0.5 mM的 DBT完全降解掉。同時轉(zhuǎn)化子對各種

12、有機硫源都有較高程度的降解。同樣使用PCR擴增的手段，得到Rhodococcuserythropolis XP 的黃素還原酶DszD的基因序列，通過活力測定確認獲得的基因為dszD。通過上面成功的克隆了有活力的dszABCD四個基因，進而測序，結(jié)果與模式菌株IGTS8的相關(guān)基因比對，dszABC的基因序列與脫硫模式菌株IGTS8的脫硫基因同源性超過99％；dszD基因與：IGTS8的同源性為98.5％。使用重組PCR的手段，獲得了dsz

13、AC基因簇，將其導入表達載體pKK223-3中，獲得的轉(zhuǎn)化子PKKAC可以有效地降解DBT，生成脫硫途徑中的倒數(shù)第二個產(chǎn)物HPBS。同時轉(zhuǎn)化子對其他各種甲基DBT也有同樣的攻擊能力，降解各種DBT類物質(zhì)生成相應的Cx-HPBS，也直接證明了Rhodococcus erythropolis XP降解DBT完全遵循報道的“4S”途徑。 首次報道了將CA 降解基因?qū)隓BT降解菌株并獲得成功。將咔唑1，9a雙加氧酶導入Rhodococ

14、cus erythropolis XP構(gòu)建了重組菌株Rhodococcuserythropolis SN8。咔唑1，9a雙加氧酶可以選擇性的降解CA生成2’-氨基聯(lián)苯-2,3-二醇，從而可以減少對加氫處理的抑制。構(gòu)建的重組菌SN8可以選擇性的降解DBT和CA，不損失燃燒值。通過實驗發(fā)現(xiàn)SN8可以同時降解水體系和正十四烷中的CA和DBT。SN8可以在6 h內(nèi)將體系內(nèi)的DBT和CA全部降解掉，并且實驗證實導入的carA基因?qū)BT的降解基本

15、無影響。進一步實驗了SN8對原油中含硫含氮化合物的降解能力，SN8休止細胞可以有效地降解FS4800原油中絕大部分的可檢測含硫化合物，同時對原油中的咔唑，一甲基至三甲基取代的咔唑類化合物都有不同程度的降解能力。此外，將負責編碼降解CA生成鄰氨基苯甲酸酶系的基因carABC導入Rhodococcus erythropolis XP構(gòu)建了重組菌株Rhodococcus erythropolis xPDN。通過GC-MS分析證實XPDN可以降

16、解DBT生成DBTO<,2>到2-HBP，同時降解CA生成鄰氨基苯甲酸。Rhodococcus erythropolisXPDN可以同時降解DBT、CA和二苯并呋喃(Dibenzofuran，DBF)這三類雜環(huán)類化合物，并且可以繼續(xù)降解2-HBP生成苯甲酸。構(gòu)建的重組菌株XPDN可以降解這三類化合物生成無毒的產(chǎn)物，在環(huán)境修復上具有一定的價值。XPDN休止細胞還能夠攻擊二惡英前體物質(zhì)dibenzo-p-dioxin(DD)，在7d之內(nèi)可以

17、完全降解掉0.1 mM的DD。 在微生物降解疏水化合物時，雙液相系統(tǒng)有助于克服污染物的生物可利用性障礙，提高污染物的生物降解速率，因而在生物催化上大量使用。然而，現(xiàn)在許多有機溶劑都是生物體毒素，甚至有些溶劑在極低的濃度(0.1％v/v)存在時也能殺死細胞。同樣燃油也同有機溶劑一樣存在相同的生物毒性。因此本工作也開展了將脫硫基因dszABCD導入一株最高可以耐受50％二甲苯的惡臭假單胞菌，構(gòu)建了能夠同時脫硫和耐受有機溶劑的工程菌株。