果蠅Aurora B抑制模型的建立和在體（in vivo）功能分析.pdf

1、近幾年在對細(xì)胞有絲分裂過程的研究中發(fā)現(xiàn)，存在著一個(gè)動點(diǎn)蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中有一類蛋白家族—染色體乘客蛋白(AuroraB，INCENP，survivin，TD-60)在細(xì)胞有絲分裂過程中扮演著重要的角色，是與染色體有效而又忠實(shí)的分離以及胞質(zhì)分裂密切相關(guān)的。研究表明，AuroraB是該乘客蛋白家族中唯一的一個(gè)具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，目前已證實(shí)可與INCENP以及Survivin組成復(fù)合物來調(diào)控自身的活性，并通過磷酸化下游底物來調(diào)

2、控有絲分裂的進(jìn)程。 為了能夠進(jìn)一步在體研究AuroraB基因的功能，了解其在果蠅發(fā)育中的作用，首先通過基因重組技術(shù)，在體外融合表達(dá)純化AuroraB-(His)6蛋白，免疫動物后經(jīng)GST-AuroraB-N截短蛋白的純化獲得抗AuroraB的多克隆抗體，經(jīng)免疫印跡法鑒定結(jié)果顯示，該抗體在原核表達(dá)體系及果蠅組織中均可檢測到目的蛋白，并有較好的特異性和反應(yīng)性。 運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，我們選用了果蠅Pelement改建的載體pW

3、IZ，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pWIZ-AuroraB-dsRNA，通過顯微注射的方法，獲得用于AuroraB抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因果蠅。基于GAL4-UAS系統(tǒng)，選擇不同的GAL4-品系果蠅與我們的轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交。結(jié)果顯示，在da-GAL4或Actin-GAL4驅(qū)動抑制AuroraB表達(dá)時(shí)，會導(dǎo)致90％以上的果蠅蛹期致死，當(dāng)轉(zhuǎn)基因果蠅pWIZ-AuroraB-dsRNA與eyeless-GAL4雜交后，可以驅(qū)動AuroraB在果蠅眼睛成蟲盤MF前

4、的細(xì)胞內(nèi)沉默，結(jié)果顯示50％的果蠅會致死，還有50％的果蠅大部分表現(xiàn)為復(fù)眼的缺陷表型，通過掃描電鏡和果蠅復(fù)眼切片的H.E染色進(jìn)一步表明，在果蠅眼睛成蟲盤干涉AuroraB后由于細(xì)胞分裂的異常，導(dǎo)致ommatidia數(shù)目的減少以及排列規(guī)律的打破。在Vg-GAL4的驅(qū)動下抑制AuroraB在翅膀成蟲盤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，會引起果蠅翅膀發(fā)育的異常，并且翅膀發(fā)育缺陷同復(fù)眼缺陷表型一樣常表現(xiàn)出不對稱性。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，果蠅AuroraB激酶對果蠅