紫花苜蓿對低磷脅迫的響應(yīng)及相關(guān)miRNAs的功能分析.pdf

1、土壤有效磷缺乏嚴(yán)重影響了作物的生長發(fā)育，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要通過施用磷肥增加土壤有效磷，但即將枯竭的磷礦資源迫使我們從植物自身提高磷吸收利用效率。為探索苜蓿磷高效吸收利用相應(yīng)的策略及調(diào)控通路，本研究將以紫花苜蓿為材料，分析耐低磷較強(qiáng)的耐鹽之星品種低磷生理與形態(tài)響應(yīng)，以及運用組學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等手段從miRNA水平深入研究紫花苜蓿低磷應(yīng)激機(jī)制。本研究包括3部分試驗:(1)耐低磷紫花苜蓿品種的篩選:利用隸屬函數(shù)方法綜合評價25個國內(nèi)

2、外紫花苜蓿品種的耐低磷性;(2)苜蓿對低磷脅迫的生理與形態(tài)響應(yīng)分析:分別檢測常磷(05mmol/L KH2PO4)與低磷(5μmol/L KH2PO4)下紫花苜蓿生理與形態(tài)變化;(3)低磷應(yīng)激miRNAs的鑒定及功能分析:利用Illumina2500高通量測序平臺分析常磷和低磷條件下差異表達(dá)的miRNAs，并分析靶基因功能以及可能參與的調(diào)控通路。主要得到以下結(jié)果與結(jié)論:
　　1.檢測了低磷處理30d紫花苜蓿的莖葉干重、株高、根干重

3、、根冠比、總根長、根表面積、全磷含量、磷利用率以及酸性磷酸酶活性，進(jìn)一步利用主成分分析濃縮為3個新的相互獨立的綜合指標(biāo)，評價結(jié)果顯示敖漢、皇冠、耐鹽之星等的耐低磷性較強(qiáng)。
　　2.低磷脅迫下，耐低磷較強(qiáng)的苜蓿（耐鹽之星）地上部分和地下部分生長都受到抑制，但根冠比顯著增加(P＜005);根組織中的酸性磷酸酶活性增強(qiáng)，低磷脅迫20d時根中的檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸分別是對照的414、267、209倍;綜合表明，紫花苜?？赡芡ㄟ^增加根冠比

4、、提高酸性磷酸酶活性以及分泌有機(jī)酸應(yīng)對低磷環(huán)境。
　　3.分別構(gòu)建了耐鹽之星常磷根(NPR)、低磷根(LPR)、常磷莖葉(NPS)和低磷莖葉(LPS)小RNA文庫，每個文庫3個生物學(xué)重復(fù)，高通量測序共鑒定到264個已知miRNAs和157個新miRNAs，根和莖葉中分別檢測到47個和44個差異表達(dá)的miRNAs，其中包括低磷誘導(dǎo)上調(diào)的miR399、miR398、miR5287等，和低磷誘導(dǎo)下調(diào)的miR156、miR160、miR1

5、69、miR171、miR2643、miR396等。
　　4.利用psRNATarget、TargetFinder和Tapirhybrid軟件綜合預(yù)測到909個差異表達(dá)的miRNA靶基因，主要包括參與生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子(MYB、AP2、GRAS、CCAAT和MADS等)和生長調(diào)節(jié)因子，參與根發(fā)育的生長素應(yīng)答因子，多種抗逆保護(hù)蛋白以及磷轉(zhuǎn)運蛋白等。RLM-RACE結(jié)果證明miR156、miR160a、miR160c、miR166和m

6、iR396作用的靶基因位點與預(yù)測結(jié)果一致。靶基因GO和KEGG富集結(jié)果主要包括信號傳導(dǎo)，糖類、脂肪、氨基酸基本代謝過程，激素刺激響應(yīng)、化學(xué)刺激響應(yīng)和生長素調(diào)控通路等。
　　根據(jù)苜蓿在低磷下生理與形態(tài)的響應(yīng)和差異表達(dá)的miRNAs及靶基因，miRNAs主要參與的苜蓿低磷應(yīng)激調(diào)控有:(1)氨基酸、糖類、脂肪酸等基礎(chǔ)代謝響應(yīng);(2)具有普遍抗逆保護(hù)蛋白形成的應(yīng)激響應(yīng);(3)根系的生長發(fā)育;(4)磷轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控和有機(jī)酸的分泌等低磷特異響