肺炎克雷伯臨床菌株基因組島的識(shí)別與鑒定.pdf

1、目前院內(nèi)感染在臨床感染病人中所占的比例日益增高，已經(jīng)引起人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?。院?nèi)感染多由耐藥的條件致病菌感染引起，抵抗力低下的病人如發(fā)生院內(nèi)感染，將給治療帶來更大的困難。因此找到院內(nèi)感染的傳播機(jī)制，從而有效控制院內(nèi)感染是臨床治療的一個(gè)重要方面。條件致病菌對(duì)醫(yī)院抗生素壓力環(huán)境適應(yīng)能力的增強(qiáng)以及臨床菌株中抗生素抗性基因的播散是導(dǎo)致院內(nèi)感染傳播的重要原因。先前已有大量研究發(fā)現(xiàn)，一些抗生素抗性基因正在臨床條件致病菌中廣泛播散。而一些特殊的基因元

2、件可以在不同菌株之間水平轉(zhuǎn)移，在這些元件中可以攜帶有抗生素抗性基因，這些基因元件的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了抗性基因在菌株之間的傳播。目前研究較多的可轉(zhuǎn)移基因元件包括：接合性質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等。這些基因元件中大多攜帶有各種抗生素抗性基因，它們可以通過不同的分子機(jī)制在不同的菌株之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，例如：接合性質(zhì)粒通過接合作用，整合子通過att識(shí)別位點(diǎn)特異性重組，轉(zhuǎn)座子通過兩端攜帶的重復(fù)序列來達(dá)到重組的目的。這些基因元件的傳播在一定程度上導(dǎo)致了臨床耐藥菌株的

3、播散。
　　 另一方面，在臨床條件致病菌株感染過程中，抵抗抗生素抗性壓力只是其中的一個(gè)方面，除此之外，這些臨床菌株還需要適應(yīng)各種各樣的生存環(huán)境壓力，包括溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)等等方面。而如何適應(yīng)這些惡劣的環(huán)境，完成自身的生存，需要這些臨床菌株能夠快速的適應(yīng)外界環(huán)境(包括抗生素抗性)多種方面的改變。近年來人們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在微生物的全基因組中，大部分的基因高度保守，稱為“基因骨架”，另外一部分基因則變異性很大，稱為“可變基因池”

4、，而這部分“可變基因池”主要是由于基因的水平轉(zhuǎn)移形成。近來有研究發(fā)現(xiàn)，一些大的基因片段可以在不同菌株之間水平移動(dòng)，這些基因片段不同于接合性質(zhì)粒、整合子或者轉(zhuǎn)座子，它們自身具有一些典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：常位于tRNA基因位點(diǎn)后面；常攜帶有編碼整合酶或轉(zhuǎn)座酶的基因；GC含量與基因組的保守骨架不同；攜帶有一些重復(fù)序列；基因片段大小不等，大的可達(dá)100 kb以上等。這些片段攜帶的基因也是多種多樣的，可攜帶有與抗生素抗性相關(guān)的基因，也可攜帶有致病相關(guān)因

5、子或者代謝相關(guān)基因等等。現(xiàn)在將具有以上特征的這些基因片段統(tǒng)稱為“基因組島(Genomic Island，GI)”?；蚪M島的水平轉(zhuǎn)移是形成“可變基因池”的主要來源之一，對(duì)于微生物在短時(shí)間內(nèi)獲得新特性快速適應(yīng)環(huán)境從而實(shí)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)的進(jìn)化具有重要意義。
　　 目前基因組島已經(jīng)在多種菌株中發(fā)現(xiàn)，研究較多的菌株包括Escherichiacoli、Salmonella enterica等。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumon

6、iae)是臨床常見的條件致病菌之一，目前發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯很多臨床菌株可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰氨酶，有的還攜帶有超廣譜β-內(nèi)酰氨酶，導(dǎo)致對(duì)常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。目前在K.pneumoniae菌株中也發(fā)現(xiàn)一個(gè)來源于耶爾森菌屬與致病相關(guān)的基因組島。但是是否在K.pneumoniae臨床菌株中存在著其它的基因組島對(duì)于K.pneumoniae臨床菌株的生存以及致病具有重要意義，目前還沒有相關(guān)研究，因此本課題的目的是挖掘K.pneumoniae臨床

7、耐藥菌株中的基因組島，探討K.pneumoniae臨床耐藥菌株播散的相關(guān)分子，為臨床K.pneumoniae臨床耐藥菌株播散的檢測(cè)以及控制提供一定的線索。
　　 由于基因組島大小不等，變異較大，因此很難找到一個(gè)簡(jiǎn)單高效的篩選基因組島的方法。有人曾采用基因芯片的方法對(duì)基因組島進(jìn)行篩選，但此方法費(fèi)用較為昂貴，難以用于臨床菌株基因組島的普篩。由于基因組島的一個(gè)典型特征就是位于tRNA基因位點(diǎn)后面，歐竑宇等人采用生物信息學(xué)方法對(duì)肺炎克雷

8、伯菌株的tRNA基因位點(diǎn)進(jìn)行分析，確定了一些可能為基因組島插入熱點(diǎn)的tRNA基因位點(diǎn)。同時(shí)進(jìn)一步對(duì)這些位點(diǎn)的上下游保守序列進(jìn)行分析，基于該位點(diǎn)上下游的保守序列設(shè)計(jì)特異性的引物對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行篩選，根據(jù)PCR結(jié)果來確定是否有基因組島插入。
　　 (1)K.pneumoniae臨床耐藥菌株中基因組島的篩選針對(duì)生物信息學(xué)分析確定的基因組島可能的插入熱點(diǎn)進(jìn)行PCR篩選，我們發(fā)現(xiàn)arg6 tRNA、asn34 tRNA、phe55 tRNA以

9、及met56 tRNA這四個(gè)基因位點(diǎn)確實(shí)是基因組島的插入熱點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)51株臨床菌株在這四個(gè)位點(diǎn)上有83個(gè)位點(diǎn)上可能有基因組島的插入，其中arg6tRNA基因位點(diǎn)16個(gè)，ash34 tRNA基因位點(diǎn)9個(gè)，met56tRNA基因位點(diǎn)7個(gè)，而phe55 tRNA基因位點(diǎn)則全部沒有得到空位點(diǎn)長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物。51株K.pneumoniae臨床菌株phe55 tRNA位點(diǎn)處有44株臨床菌株得到了3.7 kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，我們將這個(gè)片段命名為

10、KpGI-1，1株臨床菌株(HS04160)得到了6.4 kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，我們將這個(gè)片段命名為KpGI-2，6株臨床菌株沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，懷疑有大的基因組島插入。在K.pneumoniae MGH78578基因組中，在這個(gè)位點(diǎn)有一個(gè)12.6 kb的基因組島插入，我們將它命名為KpGI-3。基因組島KpGI-3中攜帶了1個(gè)整合酶基因和7個(gè)鞭毛編碼相關(guān)基因。通過PCR篩選，我們發(fā)現(xiàn)菌株HS04053擴(kuò)增得到了KpGI-3中7個(gè)鞭

11、毛編碼相關(guān)基因，但是沒有整合酶基因，而是一個(gè)更長(zhǎng)的基因片段取代了這個(gè)整合酶基因。因此我們可以判斷在HS04053攜帶有一個(gè)變異了的KpGI-3基因組島。
　　 (2)KpGI-1和KpGI-2確定為新的基因組島我們將3.7 kb的PCR產(chǎn)物KpGI-1和6.4 kb的PCR產(chǎn)物KpGI-2進(jìn)行測(cè)序，我們對(duì)KpGI-1和KpGI-2的基因序列分析發(fā)現(xiàn)，KpGI-1的GC含量為46.75％，KpGI-2的GC含量為38.03％，與K

12、.pneumoniae MGH78578基因組57.5％的GC含量存在明顯不同。同時(shí)KpGI-1和KpGI-2基因序列中，存在著163 bp的重復(fù)序列(DR)，這個(gè)163 bp的DR序列與K.pneumoniae MGH78578中的KpGI-3中的163 bp的DR序列完全一致。KpGI-1的orf2中攜帶有一個(gè)與轉(zhuǎn)座酶一致的保守的結(jié)構(gòu)域(pfam01527)，KpGI-2的orf1中攜帶有一個(gè)不完整的整合酶基因(CAD06800)。

13、KpGI-1和KpGI-2的這些特點(diǎn)完全符合基因組島的特征，因此可以將KpGI-1和KpGI-2定義為兩個(gè)新的基因組島。
　　 通過對(duì)新基因組島KpGI-1和KpGI-2的DNA序列進(jìn)行分析，KpGI-1中的orfs與目前已知的蛋白同源性均較低，但是有的基因中含有與已知基因一致的保守的結(jié)構(gòu)域。KpGI-1中的orfs含有的結(jié)構(gòu)域與乙?；D(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域(pfam00583)一致，KpGI-1中的orf4含有一個(gè)未知的結(jié)構(gòu)域。與Kp

14、GI-1相似，KpGI-2中的大部分orfs與目前已知的蛋白同源性均較低，KpGI-2中的orf4含有結(jié)構(gòu)域DEXDc(DEAD-like helicases superfamily)(CDD accession no.cd00046)和HELICc(Helicase superfamily c-terminal domain)(pfam00271)。KpGI-2中的ORF5與Salmonella enterica Weltevrede

15、n HI_N05-537菌株中的Fic蛋白具有高度同源性，并且ORF5同時(shí)含有Fic(filamentation induced by cAMP，F(xiàn)ic)蛋白家族的結(jié)構(gòu)域(pfam02661)。
　　 (3)基因組島KpGI-2來源分析加基因最初在E.coil菌株中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為參與了cAMP誘導(dǎo)下細(xì)菌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。我們發(fā)現(xiàn)加基因不僅在E.coil菌屬中高度保守，同時(shí)在K.pneumoniae菌屬和S.enteria菌屬中也高度保守

16、。與E.coli菌屬和S.enteria菌屬不同的是，在臨床菌株來源的已測(cè)序菌株K.pneumoniae MGH78578基因組中含有兩個(gè)fic基因(kpn_03747和kpn_03553)。kpn_03747在K.pneumoniae菌屬中高度保守且與E.coil菌屬和S.enteria菌屬中的fic基因具有高度相似性，而另一個(gè)fic基因kpn_03553則與保守的加基因kpn_03747相似性較低。
　　 在51株K.pne

17、umoniae臨床菌株中，所有的菌株都含有基因kpn_03747，且與鄰近的基因也都具有高度的連鎖性。而51株K.pneumoniae臨床菌株中有3株失去了基因kpn_03553，其中一株為HS04160，失去了基因kpn_03553但攜帶有另一個(gè)fic基因，該加基因位于基因組島KpGI-2中。同時(shí)我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)KpGI-2中的加基因與Salmonella Weltevreden HI_05-537中的fic基因Sew_A3907具

18、有高度的相似性，而我們分析發(fā)現(xiàn)Sew_A3907也位于SalmonellaWeltevreden HI_N05-537菌株中phe tRNA.基因后的一個(gè)14.6kb的基因組島上。由此我們推測(cè)HS04160中的基因組島KpGI-2可能由S.enteria菌株中的基因Sew_A3907水平轉(zhuǎn)移而來。
　　 (4)KpGI-2基因組島的功能研究在E.coil K-12菌株中，cAMP可以誘導(dǎo)攜帶有fic基因的菌株發(fā)生絲化，并且使其生

19、長(zhǎng)也受到抑制，而fic基因突變株和cAMP受體(CRP)突變株在cAMP誘導(dǎo)后則沒有細(xì)菌絲化現(xiàn)象以及生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象出現(xiàn)。因此，fic基因參與了cAMP對(duì)細(xì)菌絲化和生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)過程。我們將KpGI-2中攜帶的基因分別進(jìn)行克隆，觀察這些基因以及KpGI-2在cAMP作用下對(duì)細(xì)菌形態(tài)和生長(zhǎng)的影響，我們發(fā)現(xiàn)這些基因在cAMP作用下對(duì)細(xì)菌絲化的誘導(dǎo)為非特異性的，但是對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)卻具有不同的作用?；騩rf2+orf3在cAMP作用下明顯抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)