利用10Fn3噬菌體庫(kù)篩選RON胞外段結(jié)合蛋白.pdf

1、背景：巨噬細(xì)胞刺激蛋白（MSP）受體酪氨酸激酶（RON），是酪氨酸激酶受體亞家族成員之一，通常在上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肺、骨髓等多種正常細(xì)胞中均有表達(dá)。研究表明，RON的異常表達(dá)與多種細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤的侵襲等有很大的關(guān)系，因此抑制RON的異常表達(dá)對(duì)于癌癥的治療具有重要的臨床意義。隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，已研究制備出了抗RON的單克隆單體。但由于該單克隆抗體分子質(zhì)量比較大而難以進(jìn)入組織發(fā)揮作用、來(lái)源于免疫小鼠而在人體內(nèi)易發(fā)生免

2、疫排斥反應(yīng)等缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的應(yīng)用。隨著噬菌體展示技術(shù)的快速發(fā)展，利用該技術(shù)制備的人源化的以及全人源的抗體即克服了鼠單克隆抗體異源性的缺點(diǎn)，又保留了其均一性、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)雖然噬菌體抗體庫(kù)的發(fā)展為人源抗體的制備提供了新思路，但利用該技術(shù)制備的抗體其分子量依然很大、結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜、需經(jīng)過(guò)一定的修飾（糖基化，加入二硫鍵等）才能發(fā)揮功能。因此，利用與抗體功能類(lèi)似的小分子蛋白為骨架構(gòu)建噬菌體隨機(jī)多肽庫(kù)，并利用噬菌體展示技術(shù)從中篩選出與靶標(biāo)分

3、子結(jié)合的高親和的小分子多肽已經(jīng)成為人們制備新型抗體的新方法。自然界中存在多種骨架蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)具有與重要蛋白相互作用的活性位點(diǎn)，如環(huán)狀(loop)結(jié)構(gòu)、α-螺旋或β-折疊等，具有這些結(jié)構(gòu)的骨架蛋白暴露在外邊的某些堿基組成的結(jié)合位點(diǎn)與抗體的互補(bǔ)決定域(Complementarity Determining Region，CDR)具有相似功能，使得這些骨架蛋白具有了構(gòu)建隨機(jī)多肽庫(kù)的可能。其中骨架蛋白第十人纖維素類(lèi)型III域（The ten

4、th human fibronectin type III domain，10Fn3)就是一種常見(jiàn)的骨架蛋白，其在人總蛋白中約占2％，含量比較高，在細(xì)菌噬菌體中也有發(fā)現(xiàn)。因?yàn)?0Fn3結(jié)合了多種用于治療用分子的特征而在1998年第一次被提出作為支架構(gòu)建噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)。與其他骨架相比，10Fn3具有免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）樣結(jié)構(gòu)域，并且在N端和C端存在能夠與大分子結(jié)合的β-折疊樣非連續(xù)循環(huán)結(jié)構(gòu)。此外疏水核心的Ig樣

5、域提供了一個(gè)穩(wěn)定的框架結(jié)構(gòu)，使10 fn3具有較高的熱穩(wěn)定性(Tm約為88℃)。重要的是，與可變的Ig相比，作為一種單體、缺乏穩(wěn)定的半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)錄后修飾、在細(xì)菌中快速高效表達(dá)的10Fn3，其結(jié)構(gòu)是比較穩(wěn)定的。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選取了10Fn3作為支架，并將BC和FG循環(huán)結(jié)構(gòu)中的氨基酸隨機(jī)化，依此構(gòu)建了限制性的構(gòu)象型隨機(jī)肽庫(kù)，并利用噬菌體展示技術(shù)，從中篩選出了與RON結(jié)合的高親和力小分子蛋白的陽(yáng)性克隆。
　　目的：構(gòu)建以骨架蛋白10

6、Fn3為基礎(chǔ)的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，并從該隨機(jī)多肽庫(kù)中篩選出與RON胞外段結(jié)合的高親和力蛋白的陽(yáng)性克隆。
　　方法：⑴應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中釣取RON細(xì)胞外段區(qū)域的基因。⑵分別構(gòu)建RON細(xì)胞外段的克隆載體和表達(dá)載體。⑶采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，收取上清液并純化出RON細(xì)胞外段基因表達(dá)的蛋白。⑷通過(guò)重疊延伸PCR獲得以骨架蛋白10Fn3為基礎(chǔ)的噬菌體隨機(jī)多肽庫(kù)的基因，并將其通過(guò)酶切位

7、點(diǎn)SfiⅠ和NotⅠ與表達(dá)載體pCantab5E連接。⑸電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-Blue，建立初級(jí)噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)。菌液PCR和挑取陽(yáng)性克隆并送公司進(jìn)行測(cè)序，分別鑒定構(gòu)建的噬菌體隨機(jī)多肽庫(kù)的插入率和多樣性。⑹分別包被10μg/ml、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL，0.63μg/mL,0.31μg/mL和50μg/ml、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，3.13μg/mL,1.56μg/mL比較抗原包

8、被濃度對(duì)篩選富集結(jié)果的影響，然后用1×、4×、8×、12×、16×、20×PBST和1×、2×、4×、8×、10×、14×PBST依次洗滌比較篩選環(huán)境的苛刻程度對(duì)篩選富集結(jié)果的影響。⑺通過(guò)ELISA篩選出與RON胞外段結(jié)合的高親和力蛋白的陽(yáng)性克隆。
　　結(jié)果：①成功構(gòu)建了RON細(xì)胞外段區(qū)域的真核表達(dá)載體。②成功表達(dá)純化出抗原RON細(xì)胞外段蛋白。③成功構(gòu)建了庫(kù)容量達(dá)1.92×107的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，并成功從中篩選出了22個(gè)與RON結(jié)

9、合蛋白待篩選克隆。④通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)中篩選條件的比較，確定了洗滌條件對(duì)富集度的影響要大于RON包被濃度的影響。
　　結(jié)論：⑴構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容量為1.92×107的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，建立了一個(gè)噬菌體隨機(jī)多肽庫(kù)的技術(shù)平臺(tái)，篩選出了RON胞外段結(jié)合蛋白的陽(yáng)性克隆，為以后其功能的檢測(cè)提供了分子基礎(chǔ)。⑵通過(guò)對(duì)篩選過(guò)程中RON包被濃度及洗滌條件對(duì)富集效率的影響的比較，確定在篩選RON結(jié)合分子的過(guò)程中，PBST洗滌濃度即洗滌條件嚴(yán)格度的影響要高于包被R