基于微流體芯片的細胞操控關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、以細胞分離、篩選、捕獲、定位培養(yǎng)等技術(shù)為代表的細胞操控技術(shù)在體外診斷、基礎(chǔ)生物學(xué)等應(yīng)用與研究領(lǐng)域具有廣泛的需求和重要的價值。微流體技術(shù)對微小尺度上的流體及粒子、細胞等具有精確的操控能力，被廣泛應(yīng)用在多種細胞操控技術(shù)中。本論文以基于微流體芯片的細胞操控技術(shù)為研究對象，針對在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用和研究領(lǐng)域內(nèi)有重要意義的細胞分離和定位培養(yǎng)等關(guān)鍵操控技術(shù)，分別開展了矩形直通道中的細胞慣性匯聚、混合注射方式的慣性微流體細胞分離技術(shù)、基于慣性匯聚的細胞定量

2、分離與濃縮技術(shù)、結(jié)合捕獲微井和蛋白質(zhì)圖案的細胞定位培養(yǎng)技術(shù)、以及用于人體循環(huán)腫瘤細胞檢測的微流體芯片的研究，以期為生物醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用提供細胞操控方面的微流體工具與研究平臺。本文的主要工作和創(chuàng)新點如下:
　　(1)對細胞在低深寬比矩形直通道中的慣性匯聚原理和規(guī)律進行了研究，探究了粒子直徑、流速對匯聚質(zhì)量的影響，實現(xiàn)了粒子和Hep G2細胞在通道中的匯聚。在此基礎(chǔ)上，針對利用低深寬比矩形通道從高濃度、多種類混合細胞樣品中實現(xiàn)目標細胞分

3、離的困難，以血液中循環(huán)腫瘤細胞的分離為目標，實現(xiàn)了一種采用混合注射方式的微流體細胞分離方法。該方法在利用慣性匯聚的同時，也利用了剪切致擴散效應(yīng)及血液中的彈性力，實現(xiàn)了目標細胞在低深寬比矩形直通道中的匯聚以及與高濃度血細胞的分離。利用該方法，通過對血液稀釋倍數(shù)、混合注射流速等因素的探索和優(yōu)化，實現(xiàn)了從全血或低倍稀釋血液中對目標粒子或細胞的分離。芯片從全血中分離直徑18.7μm粒子的效率達到了82.5±10％，處理通量達到約5.6×108個

4、/分鐘;從2倍稀釋的血液中分離粒子的效率達到94.1±1.8％;從2倍稀釋的血液中分離Hep G2細胞的效率達到了90.8％±2.4％，處理通量達到約2.8×108個/分鐘。該方法具備直接從全血或低倍稀釋血液中分離目標細胞的能力，同時具有較高的處理通量，在諸如人體血液中循環(huán)腫瘤細胞的分離等應(yīng)用中有一定的實用價值。
　　(2)針對廣泛存的細胞定量濃縮需求，在慣性匯聚技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過定量調(diào)節(jié)出口通道的流阻比，實現(xiàn)了一種可對懸浮液中的

5、細胞進行定量分離與濃縮的微流體芯片。利用熒光粒子，探究了出口系統(tǒng)流阻對粒子在通道中的運動軌跡及匯聚質(zhì)量的影響，并通過對出口通道的流阻比的調(diào)節(jié)，實現(xiàn)了對懸浮液中粒子或細胞濃度的定量調(diào)節(jié)。該芯片能夠?qū)^廣濃度范圍內(nèi)（10萬個/毫升～180萬個/毫升）的細胞懸浮液實現(xiàn)穩(wěn)定的定量濃縮，對細胞的活性檢測和后續(xù)培養(yǎng)結(jié)果表明細胞在濃縮過程中未受到可見的損傷。與傳統(tǒng)的基于離心機的細胞濃縮方法相比，該方法在懸浮液質(zhì)量、細胞丟失率、細胞損傷、處理時間、一致

6、性、人員操作要求等方面均體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中廣泛存在的細胞定量濃縮需求提供了一種高效便捷的微流體技術(shù)。
　　(3)結(jié)合細胞捕獲微井和微接觸轉(zhuǎn)印技術(shù)，實現(xiàn)了一種單細胞水平上的、無需對細胞施加物理和化學(xué)束縛的圖案化定位培養(yǎng)芯片。通過對微接觸轉(zhuǎn)印技術(shù)的工藝流程的優(yōu)化，成功在封閉的微流體通道中集成了空間上相互對準的細胞捕獲微井和蛋白質(zhì)圖案。利用捕獲微井對細胞進行捕獲，并在重力作用下將細胞釋放到蛋白質(zhì)圖案上，實現(xiàn)了單細胞水

7、平上的細胞捕獲和圖案化培養(yǎng)。分別使用HeLa細胞和SGC-996細胞在芯片內(nèi)實現(xiàn)了長達6天的圖案化定位培養(yǎng)，并對兩種細胞在芯片內(nèi)的貼壁、生長、遷移、增殖等過程進行了觀察與研究。該微流體芯片摒棄了傳統(tǒng)定位培養(yǎng)方法中存在的物理空間及化學(xué)成分上對細胞的束縛，提供了一種更為接近真實生長條件的、單細胞水平上的圖案化細胞定位培養(yǎng)手段，在細胞遷移、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)培養(yǎng)、藥物篩選、單細胞分析、細胞間作用等研究與應(yīng)用領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。
　　(4)實現(xiàn)