呼吸道合胞病毒調(diào)控支氣管哮喘的免疫學(xué)機制：圍繞γδT細胞和IL-33-ST2信號通路的研究.pdf

1、目的：支氣管哮喘是以氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征表現(xiàn)的、一類復(fù)雜的呼吸道炎癥性疾病，其發(fā)病機理復(fù)雜，與遺傳、變應(yīng)原刺激、空氣污染和呼吸道病毒感染等因素有關(guān)。在引發(fā)呼吸道感染的諸多病毒中，呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus，RSV)既是引起嬰幼兒和免疫缺陷人群下呼吸道感染最常見的病原體，也是誘發(fā)支氣管哮喘或引起哮喘加重的常見原因。RSV感染調(diào)控支氣管哮喘的機制尚不完全明確，推測可能與病毒感染影響肺組織局部

2、免疫應(yīng)答類型和強弱有關(guān)。通常認為Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡是介導(dǎo)支氣管哮喘，特別是過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵的免疫學(xué)事件。利用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘發(fā)的過敏性哮喘實驗?zāi)Ｐ?，本實驗小組前期研究表明感染發(fā)生的時間點影響RSV對過敏性哮喘的調(diào)控作用:致敏前病毒感染（RSV+OVA）能夠抑制實驗鼠過敏性哮喘的發(fā)展，而致敏后病毒感染(OVA+RSV)無此抑制效應(yīng)。具體地，致敏前病毒感染降低哮喘鼠氣道高反應(yīng)性，以及減少哮喘肺組織炎性

3、細胞浸潤。有趣的是，致敏前病毒感染明顯減少了肺組織中γδT細胞的數(shù)量。由于在該實驗?zāi)Ｐ椭羞^繼回輸?shù)摩忙腡細胞能夠明顯增加炎性細胞特別是嗜酸性粒細胞肺組織浸潤，我們推測肺組織中的γδT細胞發(fā)揮促哮喘效應(yīng)，因而致敏前RSV感染抑制過敏性哮喘可能與減少肺組織中的發(fā)揮哮喘促進作用的γδ T細胞有關(guān)。不足的是，該研究并沒有充分明確在此實驗?zāi)Ｐ椭笑忙腡細胞是促進哮喘進展的免疫細胞，也沒能揭示致敏前病毒感染減少肺組織γδT細胞的可能機制。RSV感染增

4、加肺組織局部Th2型細胞因子的釋放，引發(fā)Th2型優(yōu)勢應(yīng)答的建立，這可能是RSV誘發(fā)支氣管哮喘和引起哮喘加重的關(guān)鍵。RSV感染引起Th2型優(yōu)勢應(yīng)答的機理尚不完全清楚，是否有近年來研究較熱門的、具有Th2型免疫應(yīng)答促進效應(yīng)的白細胞介素(interleukin，IL)-33的參與呢？IL-33是一種在上皮細胞和內(nèi)皮細胞的細胞核中組成性表達的“警惕素”，因此有較大可能在RSV感染的情形下從病毒損傷的這些細胞被動釋放;另一方面，大量研究已證實IL

5、-33與其受體ST2組成的信號通路（即IL-33/ST2信號通路）在介導(dǎo)Th2型優(yōu)勢應(yīng)答建立和支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的重要作用:IL-33/ST2信號通路活化引起下游Th2型細胞因子如IL-13的大量產(chǎn)生，促使Th2型優(yōu)勢應(yīng)答在疾病的早期即建立;RSV病毒感染和感染誘發(fā)的Th2型優(yōu)勢應(yīng)答與IL-33/ST2信號通路的關(guān)聯(lián)性目前尚未見報道。本研究圍繞γδ T細胞和IL-33/ST2信號通路探討RSV感染調(diào)控支氣管哮喘的免疫學(xué)機制。一方面

6、，在OVA過敏性哮喘實驗?zāi)Ｐ?，我們通過過繼回輸實驗進一步明確了γδ T細胞發(fā)揮的促Th2型免疫應(yīng)答和促哮喘效應(yīng)。隨后，我們重點探究了在這一實驗?zāi)Ｐ椭兄旅羟安《靖腥緶p少肺組織γδ T細胞的機制。我們發(fā)現(xiàn)致敏前RSV感染通過增加肺組織中γδ T細胞發(fā)生依賴FasL的細胞凋亡造成其數(shù)量減少，從而削弱其發(fā)揮的促哮喘效應(yīng)，抑制了支氣管哮喘的發(fā)展;另一方面，利用RSV病毒急性感染實驗?zāi)Ｐ?，我們探討了RSV感染、Th2型優(yōu)勢免疫應(yīng)答和IL-33/ST

7、2信號通路之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，旨在為加深理解RSV調(diào)控肺組織局部免疫應(yīng)答和支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。
　　方法：通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測Mock、OVA、RSV+OVA和OVA+RSV組別鼠（過繼與非過繼回輸γδT細胞）肺組織中Th1型細胞因子干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、Th2型細胞因子IL-4和Th17型細胞因子IL-1

8、7A水平;通過ELISA檢測哮喘鼠血清中總免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E、OVA-IgE、OVA-IgG1和OVA-IgG2a水平;流式細胞術(shù)分析哮喘鼠肺組織和脾臟中γδT細胞表面Fas配體即FasL的表達;流式細胞術(shù)分選哮喘鼠肺組織中γδ T細胞，體外培養(yǎng)24小時后FITCAnnexinⅤ和PI雙染法測定其凋亡發(fā)生;利用qRT-PCR和ELISA分別在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平測定RSV感染后不同時間點肺組織中細胞因子IL

9、-33、IL-13、IL-5、IL-4、IFN-γ和IL-17A的產(chǎn)生;通過qRT-PCR檢測RSV感染肺組織中ST2的轉(zhuǎn)錄水平;流式細胞術(shù)檢測病毒感染肺組織中CD45+ST2+細胞浸潤，并分析γδ T細胞、嗜酸性粒細胞和CD3+CD4+細胞表面IL-33受體ST2的表達;蘇木素-伊紅染色（hematoxylin eosin staining，H&E）分析病毒感染后肺組織病理改變;瑞士吉姆薩(Wright-Giemsa)“染色”支氣管肺

10、泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎性細胞，并根據(jù)各類細胞組織學(xué)形態(tài)行炎性細胞分類計數(shù);測定RSV感染后不同時間點肺組織病毒滴度，表示為半數(shù)組織細胞感染量(tissue culture infective dose，TCID50);ST2單克隆抗體阻斷IL-33/ST2信號通路，利用上述實驗方法檢測細胞因子產(chǎn)生、肺組織病理、BALF炎性細胞和肺組織RSV病毒滴度的改變;流式細胞術(shù)分析IL-3

11、3/ST2信號通路阻斷后病毒感染鼠肺組織中ST2+嗜酸性粒細胞和ST2+CD3+CD4+數(shù)量變化。
　　結(jié)果：⑴致敏前RSV感染減少IL-4和IL-17A的分泌，同時增加IFN-γ的產(chǎn)生。⑵過繼回輸γδ T細胞增加IL-4的產(chǎn)生，抑制IFN-γ的分泌，但對IL-17A無明顯影響。⑶致敏前RSV感染明顯減少總IgE和OVA-IgE的產(chǎn)生，而過繼回輸γδT細胞增加了哮喘鼠血清中總IgE和OVA-IgG1水平。⑷致敏前RSV感染明顯增加

12、哮喘鼠肺組織中FasL+γδ T細胞數(shù)量，但在脾臟無此發(fā)現(xiàn)。⑸致敏前RSV感染增加肺組織γδ T細胞發(fā)生依賴FasL的細胞凋亡。⑹RSV急性感染增加肺組織中IL-33和ST2表達，并增加CD45+ST2+細胞肺組織浸潤。⑺RSV感染增加肺組織中ST2+γδ T細胞、ST2+嗜酸性粒細胞和ST2+CD3+CD4+細胞的浸潤。⑻RSV急性感染增加IL-4、IL-5、IL-13和IL-17A的表達，而阻斷IL-33/ST2信號通路明顯減少IL

13、-13表達，但對IL-4和IFN-γ無明顯影響。⑼阻斷IL-33/ST2信號通路明顯減輕RSV感染誘發(fā)的肺組織病理改變，并減少了感染鼠肺組織中ST2+嗜酸性粒細胞和ST2+CD3+CD4+細胞。⑽阻斷IL-33/ST2信號通路對RSV病毒的增殖和清除無明顯影響。
　　結(jié)論：①在OVA過敏性哮喘模型，γδT細胞增強Th2型免疫應(yīng)答，發(fā)揮促哮喘效應(yīng)，而致敏前RSV感染明顯增加肺組織中γδT細胞發(fā)生FasL介導(dǎo)的細胞凋亡，從而削弱了其發(fā)