融合肽minTBP-1-PRGDN涂層影響鈦表面成骨細胞粘附、增殖及分化功能的體外研究.pdf

1、金屬鈦因其良好的耐腐蝕性、生物相容性和骨整合性，在臨床上已廣泛用作于牙科修復種植體、正畸支抗種植體或人工關(guān)節(jié)。鈦種植體穩(wěn)定性是其植入成功的關(guān)鍵，多種活性肽和蛋白已被用于修飾鈦種植體表面，以促進骨與種植體之間的達到穩(wěn)定的骨性整合。RGD (Arg-Gly-Asp)肽作為大部分細胞外基質(zhì)蛋白（包括一些礦化相關(guān)蛋白）的共有序列，是目前最有效和應(yīng)用廣泛和的促進生物材料表面細胞粘附的肽，而如何將肽固定于生物材料的表面是提高細胞粘附的前提。學者們試

2、圖借助于羥基、氨基或羧基等功能基團，將RGD通過共價結(jié)合的方式固定在生物材料的表面。然而，這些偶聯(lián)方式存在一些缺點：除了復雜的處理過程外，偶聯(lián)劑的毒性或者活性基團因水解而失活等現(xiàn)象均不容忽視。TBP-1（RKLPDAPGMHTW）是一種新的從12肽噬菌體庫中分離出來的肽適體，其具有與金屬鈦特異性相互作用的能力，其N端的RKLPDA （minTBP-1）序列是鈦結(jié)合的重要位點。鑒于其對鈦強大的特異性識別能力，minTBP-1常以與其他基序

3、相結(jié)合形成融合肽，使得這些融合肽被賦予了同樣的對鈦特異性識別的能力。鑒于此，本研究合成一種含有RGD和 minTBP-1序列的融合—RKLPDAPRGDN，探討其與鈦表面的相互作用；以及用該融合肽作為鈦表面涂層，探討對成骨細胞附著、伸展、增殖、分化及礦化功能方面的影響。
　　
　　 第一部分融合肽minTBP-1-PRGDN與鈦表面相互作用的研究目的探討融合肽minTBP-1-PRGDN、minTBP-1及PRGDN在

4、不同濃度時對鈦親和性的影響；氧化和未氧化鈦表面對三種肽結(jié)合能力的影響；FITC標記對肽結(jié)合能力影響。
　　 方法實驗一：鈦片經(jīng)順序打磨、清洗、消毒備用，三種肽以不同濃度（1μg/ml，10μg/ml， 100μg/ml，1000μg/ml）孵育鈦片過夜，雙蒸水洗去未結(jié)合的肽。實驗二：鈦片經(jīng)順序打磨、清洗、一部分經(jīng)30％硝酸氧化（另一部分不氧化）、消毒備用，XPS檢測氧化與未氧化鈦片表面元素成分；三種肽以100μg/ml濃度分別孵

5、育氧化和未氧化的鈦片過夜，雙蒸水洗去未結(jié)合的肽。實驗三：鈦片經(jīng)順序打磨、清洗、氧化、消毒備用，三種肽以100μg/ml濃度按照未標記與標記比例為0：1（None）、10：1、100：1分別孵育鈦片過夜，雙蒸水洗去未結(jié)合的肽。熒光顯微鏡拍照，IPP圖像分析軟件采集熒光照片的像素點、以平均每個鈦片上的熒光像素點的數(shù)量作為結(jié)合到鈦片表面的肽數(shù)量的間接反映。
　　 結(jié)果實驗一：三種肽隨著濃度的增加其結(jié)合到鈦片上的數(shù)量均逐漸增加，100μ

6、g/ml時各種肽在鈦片的結(jié)合接近飽和。實驗二：經(jīng)氧化后的鈦片表面氧元素含量增加；minTBP-1-PRGDN和minTBP-1在氧化的鈦片表面的結(jié)合數(shù)量增加，而PRGDN肽數(shù)量減少。實驗三：隨著未標記肽摻入到標記肽中的比例增加，鈦片表面熒光數(shù)量減少。
　　
　　 第二部分融合肽minTBP-1-PRGDN對成骨細胞粘附的影響目的探討不同肽涂層的鈦表面對成骨細胞附著數(shù)量、伸展形態(tài)及面積、粘附相關(guān)基因表達的影響。
　

7、　 方法鈦片經(jīng)順序打磨、清洗、氧化、消毒備用，三種肽以100μg/ml濃度孵育鈦片表面過夜，未有肽孵育組作為空白對照；PBS洗去未結(jié)合的肽；成骨細胞在鈦片表面生長一定時間后（實驗四、五為1h，實驗六為24h），PBS洗去未粘附細胞。實驗四：Alamar Blue比色法檢測附著細胞的數(shù)量；實驗五：FITC-鬼筆環(huán)肽染色粘附細胞，熒光顯微鏡照相，IPP軟件分析細胞伸展面積；實驗六：RT-PCR熒光定量檢測Integrinβ1和Cadher

8、in-11基因表達。
　　 結(jié)果實驗四：minTBP-1-PRGDN涂層鈦片上附著的成骨細胞數(shù)量最多、PRGDN涂層組的細胞數(shù)量最少；實驗五：minTBP-1-PRGDN融合肽涂層的鈦片表面的成骨細胞伸展充分、面積最大，但細胞偽足少；PRGDN涂層的鈦片表面成骨細胞伸展最不充分，多接近于立方形，伸展面積與其他各組相比也是最?。粚嶒灹篒ntegrinβ1和Cadherin-11基因表達量在PRGDN組均為最高。
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9、br>　　 第三部分融合肽minTBP-1-PRGDN對成骨細胞增殖的影響目的探討不同肽涂層的鈦表面對成骨細胞增殖數(shù)量、形態(tài)及相關(guān)基因表達的影響。
　　 方法實驗七：MTT比色法檢測四組成骨細胞在24h、48h、72h時的增殖數(shù)量；細胞經(jīng)Giemsa’s染色后金相顯微鏡觀察在增殖72h時的形態(tài)；實驗八：RT-PCR熒光定量檢測Collagen Iα1和Cyclin D1基因表達。
　　 結(jié)果實驗七：各組細胞隨時間延長數(shù)

10、量逐漸增加，24h時minTBP-1-PRGDN涂層鈦片表面的成骨細胞數(shù)量最多；72h時各組細胞大部分呈長梭形，伸展充分，并沿著鈦片表面打磨的痕跡方向排列；實驗八：cyclin D1：對照組外，其余各組表達量隨時間延長而增加；達到72h時，minTBP-1-PRGDN組的cyclin D1表達量最大。Collagen Iα1：各組表達量隨時間延長降低后又有所增高；24 h時，PRGDN組的表達量最高；48h時，空白對照組表達量最低；72

11、h時，minTBP-1組表達量最高。
　　
　　 第四部分融合肽minTBP-1-PRGDN對成骨細胞分化及功能的影響目的探討不同肽涂層的鈦表面對成骨細胞分化過程中ALP酶活性、礦化相關(guān)基因表達、礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量及面積大小的影響。
　　 方法實驗九：PNPP法檢測成骨細胞誘導分化第3，7，10，14，21，28d時的ALP酶活性；實驗十：RT-PCR熒光定量檢測ALP、OPN、BSP、OC基因表達；實驗十一：細

12、胞誘導礦化28d后，茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)，金相顯微鏡照相，IPP軟件分析各組結(jié)節(jié)數(shù)量及平均面積。
　　 結(jié)果實驗九：各組成骨細胞誘導3～10d內(nèi)，ALP活性值緩慢遞增，從14d開始，ALP量的增加開始加速，28d時達到峰值；實驗十：minTBP-1-PRGDN涂層表面成骨細胞分泌的OPN、OC、BSP及ALP四種基因的表達趨勢均為：隨著時間的延長，表達量先上升后降低，且在第14天時達到高峰。而minTBP-1涂層表面成骨細胞分泌的

13、這四種基因的表達趨勢均為隨著時間的延長，表達量逐漸上升?？瞻讓φ战M中，除了OC表達先降低后增高以外，其余三種基因的表達均為逐漸升高。而PRGDN組中除了BSP的表達先增加后減少外，其他三種基因的表達均為先降低升高。四種基因在第7d時，PRGDN組的表達均為最高；第14d時minTBP-1-PRGDN組表達量最高；實驗十一：minTBP-1-PRGDN組的結(jié)節(jié)面積最大而minTBP-1組的平均面積最?。唤Y(jié)節(jié)數(shù)量在PRGDN組最多而minT