芳香基硫酸酯酶抑制劑的篩選及應用初探.pdf

1、芳香基硫酸酯酶(ARS)是一類水解芳香基硫酸酯的酶，在9種已知的芳香基硫酸酯酶中，ARSA和ARSB廣泛分布于人體各個器官和組織中。芳香基硫酸酯酶活性的變化與組織細胞內生理和病理條件的改變具有密切的相關性。在多種惡性疾病和腫瘤病癥中，芳香基硫酸酯酶活力都呈現顯著的升高，它作為標志物在臨床診斷中已經得到廣泛的應用。而芳香基硫酸酯酶作為腫瘤治療的靶點還尚待研究。本課題旨在建立一種簡便快速、高效靈敏的芳香基硫酸酯酶抑制劑篩選模型和藥效檢測模型

2、，即根據改進的芳香基硫酸酯酶活性的測試方法，建立并優(yōu)化篩選體系;采用該篩選體系對經過預選的多種天然產物進行篩選;結合酶學和細胞能量代謝水平的檢測，以獲得對腫瘤細胞中芳香基硫酸酯酶ARS有顯著影響的天然產物小分子抑制劑，并研究芳香基硫酸酯酶抑制劑對于腫瘤細胞整體的影響。
　　 本課題通過測試肺癌細胞系A549、PC-9、A427的芳香基硫酸酯酶活性，由于A549細胞ARS酶活力明顯高于其他兩株細胞系，而選擇通過A549細胞裂解總蛋

3、白的方式獲得芳香基硫酸酯酶，并根據現有的酶活力測試方法，改進并建立了用于篩選芳香基硫酸酯酶抑制劑的方法。該方法利用4-MUS為底物，在365nm波長下激發(fā)，通過讀取450nm波長下發(fā)射光數值后計算比較可篩選芳香基硫酸酯酶抑制劑。此后本課題通過以Frex-Mit、Frex-Cyt質粒轉染PC-9細胞系的方式，獲得了能在500nm下激發(fā)，在530nm下發(fā)射熒光而反映細胞內NADH代謝強度的細胞系。通過Gefitinib藥物作用，驗證了這一生

4、物探針在PC-9細胞中的靈敏性，并且檢測到PC-9胞漿內NADH代謝的顯著變化。通過此技術手段，建立了能夠快速檢測候選藥物對于腫瘤細胞影響效果的模型。通過對121種天然產物小分子的篩選，初步獲得了2種較有研究價值的天然產物小分子3-G6和4-H(1)1。在1μM和10μM濃度下利用這兩種天然產物小分子對A427、A549和PC-9細胞進行了細胞woundhealing實驗，這兩種天然產物小分子在1μM下對細胞劃痕愈合速率產生的影響不顯著