小鼠超數(shù)排卵后胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討小鼠通過不同激素劑量超排處理及不同間隔時(shí)間重復(fù)超排處理后其胚胎質(zhì)量是否受到影響，以及septin2蛋白是否影響胚胎質(zhì)量的初步研究。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：
　　1．選取8周齡小鼠120只，隨機(jī)分成4組，依次為自然發(fā)情組(0IU)、5IU組、7.5IU組、10IU組，每組30只，自然發(fā)情組不注射激素，其它各組分別注射PMSG（5IU/只）+ hCG（5IU/只）、PMSG（7.5

2、IU/只）+ hCG（7.5IU/只）、PMSG（10IU/只）+ hCG（10IU/只）。
　　2.小鼠超排后與雄性小鼠合籠，次日晨將見栓的雌鼠處死取胚，撿取1-細(xì)胞期胚胎并計(jì)數(shù)，同時(shí)通過鏡檢計(jì)數(shù)胚胎畸形率。將發(fā)育正常的1-細(xì)胞期胚胎置37℃，5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到囊胚，計(jì)數(shù)2-細(xì)胞胚胎數(shù)、4-細(xì)胞胚胎數(shù)、8-細(xì)胞胚胎數(shù)、桑葚胚數(shù)及囊胚數(shù)，并計(jì)算各時(shí)期胚胎百分率。
　　3.收集培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液中

3、IGF-II含量。
　　4.將囊胚用H33258染色后，共聚焦顯微鏡觀察
　　實(shí)驗(yàn)二：
　　選取8周齡小鼠40只，隨機(jī)分成4組，依次為0組（超排后與雄性小鼠合籠，第二天晨將見栓小鼠取胚），1組（于第一次超排處理后間隔5天，即1個(gè)性周期后，再次誘導(dǎo)超排），2組（于第一次超排后間隔2個(gè)性周期，即10天后再次誘導(dǎo)超排），3組（于第一次超排后間隔3個(gè)性周期，即15天后再次誘導(dǎo)超排），每組10只。每次超排注射PMSG（7.5IU

4、/只）+ hCG（7.5IU/只）。其余步驟同實(shí)驗(yàn)一。
　　實(shí)驗(yàn)三：
　　1.選取8周齡雌性小鼠30只，采用注射PMSG（7.5IU/只）+ hCG（7.5IU/只）方法誘導(dǎo)超排，與10周齡雄性小鼠合籠見栓后，解剖后取1-細(xì)胞期胚胎，挑選出形態(tài)正常的胚胎400個(gè)，分成實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照1組兩組，每組200個(gè)。實(shí)驗(yàn)1組培養(yǎng)在FCF培養(yǎng)液中，對(duì)照1組培養(yǎng)在DMSO培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)至囊胚，統(tǒng)計(jì)囊胚個(gè)數(shù)，并將囊胚進(jìn)行α-

5、tubulin免疫熒光染色。
　　2.除400個(gè)以外的胚胎，也平均分成實(shí)驗(yàn)2組與對(duì)照2組，分別培養(yǎng)在上述兩種培養(yǎng)液中，至所需階段，用于septin2蛋白免疫熒光染色。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一
　　1.與自然發(fā)情組相比，5IU組、7.5IU組、10IU組1-細(xì)胞期胚胎顯著增多（P<0.01），7.5IU組平均胚胎數(shù)最多，并顯著多于5IU組（P<0.05）；畸形率10IU組最高，顯著高于0IU組及5IU組（P<0.0

6、5）；2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率都在95%以上，4-細(xì)胞胎胚胎發(fā)育率都下降到90%以下，各組間差異不顯著；8細(xì)胞胚胎發(fā)育率10IU組最低，顯著低于5IU組（P<0.05）；桑葚胚發(fā)育率，與5IU組相比，7.5IU組及10IU組顯著減少（P<0.05）；囊胚發(fā)育率依次為0IU>5IU>7.5IU>10IU，10IU組顯著低于其它各組（P<0.05）。
　　2.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組培養(yǎng)液中IGF-II含量依次為0IU>5IU>7.5I

7、U>10IU，10IU組顯著低于其它各組（P<0.05）。
　　3. H33258染色后發(fā)現(xiàn)，10IU組卵裂球個(gè)數(shù)稍有減少。
　　實(shí)驗(yàn)二
　　1.重復(fù)超排間隔時(shí)間越短，胚胎畸形率越高，間隔一個(gè)性周期組畸形率顯著高于間隔三個(gè)性周期組和一次超排組，而可用胚胎數(shù)越少，隨著間隔時(shí)間的延長，畸形率變小，可用胚胎數(shù)增加，當(dāng)間隔三個(gè)性周期時(shí)，基本恢復(fù)到一次超排水平。各組間2-細(xì)胞胚胎率、4-細(xì)胞胚胎率、8-細(xì)胞胚胎率以及桑葚胚率無顯

8、著性差異，但是具有隨著間隔時(shí)間延長，各階段胚胎卵裂率增高的趨勢，到間隔三個(gè)性周期后，基本恢復(fù)到一次超排水平，而對(duì)囊胚率來說，間隔一個(gè)性周期顯著低于一次超排和間隔3個(gè)性周期組（P<0.05）。
　　2. ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組培養(yǎng)液中IGF-II含量依次為0組>3組>2組>1組，含量顯著低于0組和3組（P<0.05）。
　　3..H33258染色后發(fā)現(xiàn)，1組和2組卵裂球個(gè)數(shù)有所減少。
　　實(shí)驗(yàn)三
　　1．FC

9、F處理后胚胎囊胚率顯著下降（P<0.05）；
　　2.共聚焦顯微鏡可以清楚地觀察到septin2在對(duì)照2組各階段胚胎主要表達(dá)在2-細(xì)胞期及以后的各期胚胎卵裂球中，且集中在卵裂球的核上，熒光信號(hào)強(qiáng)；在實(shí)驗(yàn)2組2-細(xì)胞期卵裂球的核上，及4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期胚胎中顆?；穆蚜亚蛑幸灿形⑷醣磉_(dá)，到桑葚胚以后幾乎無表達(dá)，且4-細(xì)胞、8-細(xì)胞胚胎有顆?；F(xiàn)象。
　　3.與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組囊胚微管排列不規(guī)則，紡錘體形態(tài)異常，染色體排列

10、紊亂上。
　　結(jié)論：
　　實(shí)驗(yàn)一
　　1. PMSG/HCG可以增加小鼠可用胚胎個(gè)數(shù)；
　　2.PMSG/HCG對(duì)小鼠超排具有一定的閾值，劑量過高及過低都不能達(dá)到理想效果；
　　3.高劑量PMSG/HCG可影響胚胎質(zhì)量，降低胚胎發(fā)育率；
　　實(shí)驗(yàn)二
　　1.重復(fù)超排間隔時(shí)間越短，對(duì)超排效果及胚胎質(zhì)量越不利；
　　2.重復(fù)超排間隔時(shí)間越短，發(fā)生卵巢囊腫的概率會(huì)有所增加；
　　3.重復(fù)超

11、排間隔時(shí)間達(dá)三個(gè)性周期以上時(shí)，可基本恢復(fù)到一次超排水平。
　　實(shí)驗(yàn)三
　　1. Septin2蛋白在小鼠早期胚胎2-細(xì)胞期到囊胚各時(shí)期均有表達(dá)，定位于卵裂球的核上；
　　2. FCF抑制劑Septin2蛋白表達(dá)可降低；
　　3.敲低Septin2蛋白表達(dá)，可致胚胎發(fā)育異常，胞質(zhì)分裂不均，卵裂球大小不一，且數(shù)量減少，染色體排列雜亂，以及導(dǎo)致胚胎“顆?，F(xiàn)象”產(chǎn)生；
　　4.敲低Septin2蛋白表達(dá)，可致囊胚中