CKLF1-C27多肽和中藥復(fù)方燈盞生脈膠囊對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的干預(yù)作用.pdf

1、研究背景：
　　間質(zhì)性肺疾病(ILD)是一組主要累及肺間質(zhì)、肺泡和細(xì)支氣管的肺部彌漫性疾病，表現(xiàn)為漸進(jìn)性氣促，限制性通氣功能障礙伴彌散功能降低。特發(fā)性肺纖維化（IPF）是最常見的一種間質(zhì)性肺疾病，主要由肺部反復(fù)的炎癥損傷和修復(fù)造成。氣道高反應(yīng)性（AHR）是支氣管哮喘的主要特征和診斷依據(jù)。但是也發(fā)現(xiàn)部分慢性咳嗽、過敏性鼻炎、病毒性上呼吸道感染、囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病也會出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性。目前對肺纖維化病人肺功能的研究主要是肺彌

2、散功能，而肺通氣功能的檢測鮮有研究，基于臨床上應(yīng)用支氣管擴(kuò)張劑改善肺纖維化患者的通氣狀況，因此我們采用Buxco小鼠無創(chuàng)肺功能儀對博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的氣道反應(yīng)性進(jìn)行研究。
　　CKLF1(趨化素樣因子-1)是我國北大學(xué)者首次在國際上報道的一種細(xì)胞因子，它是采用抑制性減數(shù)雜交技術(shù)從 PHA刺激的 U937細(xì)胞中分離得到的，對中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化作用，也參與了支氣管和肺的炎性損傷及修復(fù)過程。本課題組首次報道了C

3、KLF1在哮喘患者的外周血單核細(xì)胞及氣道粘膜中高表達(dá)并在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)支氣管肺的炎性損傷及重塑作用。因此干預(yù)CKLF1介導(dǎo)的炎癥趨化作用可能是新的治療炎癥性相關(guān)肺部疾病的靶點(diǎn)。重組CKLF1在果蠅S2細(xì)胞中表達(dá)時意外地獲得了兩種小分子多肽：C19和C27。C19和C27有較弱的體外趨化活性，但是它們的趨化效應(yīng)均比其它的CCR4配體弱，并且能抑制 CKLF1誘導(dǎo)的趨化作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示這兩種多肽均能抑制人CCL11誘導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞向腹膜腔募

4、集。C19還被報道在氣道慢性炎癥性疾病如哮喘、過敏性鼻炎中發(fā)揮著保護(hù)性作用。研究發(fā)現(xiàn)CKLF1、C19和C27均是CCR4的功能性配體，它們的相互作用均由CCR4介導(dǎo)。因此C19和C27可能是通過競爭性結(jié)合CCR4成為CKLF1的拮抗肽，對炎癥相關(guān)的肺部疾病發(fā)揮治療作用。由于肺纖維化被認(rèn)為是反復(fù)的肺損傷和異常修復(fù)造成的，而且缺乏有效安全的藥物治療，因此選擇一個特異性靶點(diǎn)研究對肺纖維化安全有效的藥物是有必要的。本課題旨在探討CKLF1的拮

5、抗多肽C27對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型的干預(yù)保護(hù)作用，為CKLF1-C27多肽成為抗纖維化新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但由于一種新藥從研發(fā)到進(jìn)入臨床是一個漫長的過程，研發(fā)階段尚不能用于改善臨床肺纖維化病人的狀況，而肺纖維化病人急需安全有效的藥物緩解病情，所以我們希望用已上市藥物，尤其是天然藥物來解決現(xiàn)有的肺纖維化病人的癥狀。
　　因此，本論文有以下兩部分內(nèi)容：第一部分是CKLF1-C27多肽對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型的干預(yù)作用研

6、究，其中對博萊霉素致小鼠肺纖維化的氣道反應(yīng)性進(jìn)行了探討；第二部分是中藥復(fù)方燈盞生脈膠囊對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的干預(yù)保護(hù)作用。
　　第一部分 CKLF1-C27多肽對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型的干預(yù)作用研究
　　分題一博萊霉素致小鼠肺纖維化的氣道反應(yīng)性研究
　　目的：
　　研究在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，博萊霉素致小鼠肺纖維化的進(jìn)程中氣道反應(yīng)性的變化。
　　方法：
　　將10只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為

7、對照組和模型組，對照組氣管滴注0.1ml生理鹽水，模型組氣管滴注0.1ml博萊霉素溶液(5mg/kg)。每天觀察小鼠生存狀態(tài)和體重變化，并于造模前、造模后第3、7、14、21天行無創(chuàng)肺功能檢測，用乙酰甲膽堿刺激，以Penh值為小鼠氣道反應(yīng)性指標(biāo)。第22天處死小鼠，留取肺組織行HE染色觀察病理改變。
　　結(jié)果：
　　造模后模型組小鼠體重急劇下降，對照組小鼠體重保持平穩(wěn)。模型組小鼠Penh值隨造模后時間延長而升高，吸入mAch后

8、Penh上升明顯，且存在濃度依賴性，而對照組小鼠改變不明顯。模型組小鼠肺組織病理呈現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)充滿炎性細(xì)胞，氣道上皮細(xì)胞脫落，氣道平滑肌細(xì)胞增生，氣道壁增厚等變化，其病理變化嚴(yán)重程度顯著高于對照組。
　　結(jié)論：
　　博萊霉素能誘導(dǎo)小鼠發(fā)生明顯的肺纖維化病變，過程中氣道反應(yīng)性升高，并且早期氣道反應(yīng)性升高的程度較后期明顯。
　　分題二CKLF1-C27多肽對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型的干預(yù)作用研究
　　

9、目的：
　　探討CKLF1-C27多肽對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的干預(yù)保護(hù)作用。
　　方法：
　　將60只 C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為空白對照組（NS組）、模型組（model組）、藥物低劑量組（C27-1μg組）、藥物中劑量組（C27-10μg組）、藥物高劑量組（C27-100μg組）和藥物對照組（C27-con組）。NS組和藥物對照組氣管滴注0.1ml生理鹽水，其余各組滴注博萊霉素溶液（5mg/kg）復(fù)制肺纖維

10、化模型，以后每天分別腹腔注射生理鹽水和不同濃度C27溶液（0.005,0.05,0.5mg/ml）治療。實(shí)驗(yàn)過程中隔天記錄小鼠的生存狀態(tài)及體重變化，在完成給藥后觀察肺順應(yīng)性和肺阻力的改變狀況。留取肺泡灌洗液和肺組織檢測TGF-β含量和羥脯氨酸含量，肺組織行HE染色觀察肺組織的炎癥變化和纖維化程度。
　　結(jié)果：
　　給予博萊霉素后，各組小鼠體重顯著下降，進(jìn)食減少，肺阻力升高（P＜0.05)，肺順應(yīng)性降低（P＜0.05)，肺組織

11、中羥脯氨酸含量顯著升高（P＜0.05)，肺泡灌洗液和肺組織中 TGF-β含量增加（P＜0.05)，肺部病理變化嚴(yán)重。三個 C27多肽干預(yù)組小鼠體重下降減緩，尤以低劑量組下降最緩慢；肺阻力顯著下降（P＜0.05)，肺順應(yīng)性稍有上升，TGF-β含量降低（P＜0.05)；肺組織中羥脯氨酸含量降低（P＜0.05)；均以低劑量組改變最明顯；肺組織的病理切片顯示肺部炎癥及肺纖維化程度均有不同程度的減輕。
　　結(jié)論：
　　CKLF1-C2

12、7多肽能改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的虛弱狀態(tài)，降低肺阻力，減少肺組織的羥脯氨酸含量，抑制小鼠的肺組織炎癥反應(yīng)，減輕肺纖維化程度，對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化具有干預(yù)作用。
　　第二部分中藥復(fù)方燈盞生脈膠囊對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的干預(yù)作用研究
　　目的：
　　研究燈盞生脈膠囊對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的干預(yù)保護(hù)作用。
　　方法：
　　將40只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為鹽水對照組（NS）、模型組

13、（Model）、燈盞生脈組（DZSM）和乙酰半胱氨酸陽性對照組（NAC），NS組氣管滴注0.1 mL生理鹽水，其余3組按5 mg/kg劑量滴注博萊霉素溶液復(fù)制肺纖維化模型，以后每天分別給予生理鹽水、燈盞生脈溶液(222 mg/kg/d)、乙酰半胱氨酸溶液（489.6 mg/kg）灌胃治療,連續(xù)給藥21 d。實(shí)驗(yàn)過程中隔天記錄小鼠的生存狀態(tài)及體重變化，在完成給藥后觀察肺順應(yīng)性和肺阻力的改變狀況。留取肺泡灌洗液檢測細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β（

14、TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）含量，觀察博萊霉素引起的肺炎癥改變；留取肺組織，測定肺組織中羥脯氨酸含量，并分別行HE染色和Masson’s染色，觀察肺組織的炎癥變化和纖維化程度。結(jié)果
　　給予博萊霉素后，各組小鼠體重顯著下降，進(jìn)食減少，肺阻力升高（P＜0.05)，肺泡灌洗液中TGF-β，TNF-α，IL-1β含量顯著升高（P＜0.05)。燈盞生脈膠囊干預(yù)組小鼠體重下降減緩，肺阻力顯著下降（