同一個(gè)體不同組織線粒體DNA異質(zhì)性的研究.pdf

1、目的：建立變性高效液相色譜法(DHPLC)快速篩選同一個(gè)體不同組織線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)高變區(qū)異質(zhì)型的方法；同時(shí)采用直接測序法驗(yàn)證其發(fā)生的頻率，為利用mtDNA進(jìn)行法醫(yī)學(xué)鑒定時(shí)作出更加合理的結(jié)果解釋提供參考。 方法：收集尸體18例，分別提取血、心肌、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺、腦組織、肌肉、皮膚、肋骨、指甲及毛發(fā)的mtDNA，共制備樣本234份；并且在本實(shí)驗(yàn)室選取三個(gè)已知序列的樣本Y1、Y

2、2和Y3。在高變區(qū)選取兩個(gè)多態(tài)性較好的區(qū)域即HVⅠ：nt16159-16391和HVⅡ：nt172-408，選用GoldTMDNA聚合酶分別進(jìn)行擴(kuò)增并且優(yōu)化擴(kuò)增條件。用已知序列的樣本建立兩個(gè)區(qū)域各自最佳的DHPLC檢測條件；采用DHPLC圖譜和直接正反向測序法均相同的1＃個(gè)體的所有樣本建立篩選不同組織間異質(zhì)型的模型。利用DHPLC篩選異質(zhì)型樣本，篩選出的異質(zhì)型樣本擴(kuò)增更長的片段(包含目的片段)用ABI310遺傳分析儀進(jìn)行正反向測序驗(yàn)證。

3、 結(jié)果：DHPLC的最佳檢測溫度是HVⅠ：59.2℃，HVⅡ：55℃。DHPLC共篩選出11例個(gè)體具有異質(zhì)性，而直接測序法驗(yàn)證只有9例個(gè)體具有異質(zhì)性，其中有4例為點(diǎn)異質(zhì)型，6例為長度異質(zhì)型，有1例既有點(diǎn)異質(zhì)型又有長度異質(zhì)型。觀察到異質(zhì)型的個(gè)體中有4例每個(gè)個(gè)體的所有樣本均在相同的位置出現(xiàn)了相同的異質(zhì)型；有2例出現(xiàn)了兩個(gè)堿基位置發(fā)生異質(zhì)性的情況。各種組織出現(xiàn)異質(zhì)型的頻率不完全相同，其范圍在27.8％-44.4％之間，其中肌肉組織出現(xiàn)