草地重建中羊草葉片cDNA文庫的構建及光合作用基因的克隆與分析.pdf

1、目前環(huán)境污染，水土流失、土地荒漠化過程加劇，草原退化、森林面積和耕地資源萎縮，土壤鹽漬化和沙化、水資源匱乏且被污染等生態(tài)環(huán)境問題、生物多樣性銳減、生物資源被破壞等成為制約國民經(jīng)濟健康持續(xù)發(fā)展的制約因素。植被建設是生態(tài)環(huán)境恢復與重建的主要任務和目標。 植被建設所必須遵從基本原則是既要體現(xiàn)它的生態(tài)性、又要體現(xiàn)它的經(jīng)濟性和社會性。依據(jù)這一基本原則，選擇和培植適宜低劣環(huán)境、具有較高經(jīng)濟價值和生態(tài)效益的植物品種材料是生態(tài)環(huán)境設中一項極端

2、重要的任務和研究內(nèi)容。本研究的目標就在于利用現(xiàn)代生物技術，為草原生態(tài)修復培植具有優(yōu)良生長習性的牧草品種。 羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)又稱堿草，屬禾本科賴草屬，其營養(yǎng)價值高，富含蛋白質(zhì)，適口性好，抗旱，耐鹽堿，耐貧瘠，抗逆性強，適應性廣等優(yōu)點，對發(fā)展草原畜牧業(yè)和退化草地修復、荒漠化治理等具有舉足輕重的作用。近年來，由于自然環(huán)境變劣，荒漠化加劇，以及過度放牧等不利影響，加之羊草本身遺傳特性有

3、“三低”問題(即結實率低、出苗率低、產(chǎn)草量低)，己對羊草生物種群優(yōu)勢構成了嚴重的威脅，限制了我國人工草地建設和天然草地的改良和土壤沙漠化治理等生態(tài)環(huán)境建設與修復的步伐。加強羊草生物學基礎研究成為當前最為緊迫的研究課題。國內(nèi)外已有的研究報導大多集中在草原生態(tài)等宏觀領域，而在羊草生物學方面缺乏系統(tǒng)的科學研究。為了提高羊草的生長量，逐步改善其“三低”問題，使其在生態(tài)環(huán)境建設中能夠發(fā)揮更大的作用，本研究以羊草幼苗葉片為實驗材料，利用試劑盒構建羊

4、草葉片cDNA文庫，并利用M13通用引物篩選文庫獲得其與光合作用相關的nabisco大小亞基基因，為挖掘羊草光合作用基因資源，為進一步改良羊草生物學習性奠定基礎。獲得了以下結果： 1.采用CLONETCH公司的SMART TM cDNA Library Construction Kit試劑盒及SMART(Switching Mechanism At 5′end of RANA Transcript)技術，成功的構建了羊草葉片c

5、DNA文庫，原始文庫都達到10<'6>cfu/ml，擴增文庫滴度接近10<'11>cfu/ml，重組率達到98％。PCR檢測插入片段，均在0.5kb到2.5kb之間，主要集中在大于1kb的區(qū)域，約占70％左右。從文庫中檢測到了羊草維生素E生物合成的關鍵酶基因α-生育酚環(huán)化酶(TC)及γ-生育酚甲基轉移酶(γ-TMT)的特異信號，表明所獲得文庫具有較高的覆蓋度，并為PCR篩選文庫提供了可能。 2．在此文庫的基礎上，利用M13通用

6、引物進行篩選，挑選大小合適的單克隆，進行測序，將測序所獲得的cDNA序列結果在美國國家生物技術信息中心(National Centerfor Biotechnology Information,NCBI)網(wǎng)站http：//www．ncbi．nlm．nih．gov．的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)上與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的其他物種的基因進行比對和分析，初步確定所克隆到的部分基因(已登錄

7、50條，在NCBI中的庫號為Leymus chinensis cv Jisheng No．1 leaf cDNA library)。 3．從亞文庫中篩選到與光合作用相關的Rubisco大小亞基基因，在GenBank上進行比對，Rubisco大亞基基因長度為1796bp，與禾本科大麥、小麥、野雀麥、粗山羊草、旱麥草、異形花草、黑麥等的核苷酸序列同源性達98％以上。而羊草的Rubisco小亞基基因部分序列含有一個開放閱讀框長度為1