紫云英參與共生固氮的結(jié)瘤素基因的分離與鑒定.pdf

1、通過(guò)抑制差減雜交，比較了紫云英接種根與不接種根在轉(zhuǎn)錄水平上的差異，建立了紫云英共生結(jié)瘤過(guò)程中的差異表達(dá)基因文庫(kù)。利用斑點(diǎn)雜交對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了初步篩選，選取在接種根中的雜交信號(hào)強(qiáng)度高于不接種根至少3倍的克隆進(jìn)行測(cè)序分析。57個(gè)cDNA克隆的測(cè)序結(jié)果表明，17個(gè)片段與豆血紅蛋白基因(肋)有著很高的同源性；3個(gè)片段分別編碼紫云英天冬酰胺合成酶基因AsASl、AsAS2；7個(gè)片段分別與早期結(jié)瘤素基因ENOD2、晚期結(jié)瘤素基因nodulin-26以及

2、來(lái)自田菁的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、羽扇豆的二磷酸核苷酸磷酸酶l基因、推測(cè)的辣椒半胱氨酸蛋白酶基因、擬南芥的RNA螺旋酶以及苜蓿的一個(gè)BAC克隆mth2-10i23表現(xiàn)出或多或少的相似性；另外，有30個(gè)片段沒(méi)有找到同源基因。 根據(jù)測(cè)序分析結(jié)果，對(duì)其中的16個(gè)基因進(jìn)一步做了Virtual Northern blot驗(yàn)證，雜交結(jié)果顯示，其中14個(gè)基因只在接種根中表達(dá)，另外兩個(gè)，4sD243和slB259在未接種根中也有一定表達(dá)，但

3、其雜交信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)低于接種根。運(yùn)用RACE法獲得了這16個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA及個(gè)別基因的基因組DNA。它們的序列分析表明，11個(gè)基因編碼的多肽與半胱氨酸簇蛋白(CCP)家族同源，其序列中均含有信號(hào)肽和幾個(gè)保守的半胱氨酸殘基；這11個(gè)多肽中，AsG257與防御蛋白2家族同源，AsD255的C-端帶有蝎毒素類(lèi)結(jié)構(gòu)域；基因組DNA序列分析顯示，AsD255中編碼信號(hào)肽的外顯子與編碼半胱氨酸簇結(jié)構(gòu)域的外顯子之間被一個(gè)內(nèi)含子隔開(kāi)。另外5個(gè)基因中，A

4、sE246和AslB259編碼著兩個(gè)不同的脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(LXP)類(lèi)似物，序列比對(duì)顯示，這兩個(gè)翻譯序列與已經(jīng)報(bào)道的豆科植物來(lái)源的LTP同源性較低，而與來(lái)自非豆科植物的LTP同源性較高；。4sD243所編碼的20-kD的蛋白質(zhì)與來(lái)自細(xì)菌Usp家族的結(jié)合ATP的MJ0577型亞家族蛋白高度同源，后者被認(rèn)為可能具有分子開(kāi)關(guān)的功能；其余兩個(gè)基因，AsG2511和AsliC259，前者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的同源序列，后者與來(lái)自羽扇豆的結(jié)瘤素基因LIDD

5、4A9有著一定的相似性。 RT-PCR分析表明，除了AsC2411、AslB259和AsD243，其它13個(gè)基因均只在接種根中表達(dá)，在根瘤發(fā)育過(guò)程中，它們開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的時(shí)間比紫云英豆血紅蛋白基因(Lb)晚2-4天。AsC2411在所有檢測(cè)的未接種根及幼齡的接種根中有一個(gè)基本表達(dá)，并在根瘤發(fā)育過(guò)程中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。AslB259在接種根不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況相似于Lb，它在33天齡的未接種根中也有所表達(dá)，但轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。與AsE246

6、相比，AslB259的表達(dá)較早。AsD243在接種和未接種根中均表達(dá)，且在成熟根中的轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)高于幼根；接種后7天，其表達(dá)量顯著增加，這比三6開(kāi)始表達(dá)的時(shí)間晚2天。在植物不同組織中的表達(dá)分析顯示，除了AsD243，其余15個(gè)基因均不在葉片和葉柄中表達(dá)，它們?cè)诟鲋械霓D(zhuǎn)錄水平都非常高，其中一些在除去根瘤的接種根中也有表達(dá)，但表達(dá)水平下降。不同于AslB259和其它被檢測(cè)基因，AsE246只在根瘤中表達(dá)，即使在除去根瘤的接種根中也不轉(zhuǎn)錄。在