慢性阻塞性肺病合并侵襲性曲霉病的臨床及實驗研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 曲霉是造成免疫受損宿主機會性感染的主要病原體之一,對于免疫功能正常的患者,痰標本中培養(yǎng)出曲霉通常被認為是定植或污染。但是越來越多的資料表明,嚴重慢性阻塞性肺病(COPD)患者也存在發(fā)生侵襲性肺曲霉病(IPA)的高風險。一項多中心的前瞻性臨床研究顯示,COPD是ICU患者曲霉感染重要的危險因素。COPD合并侵襲性肺曲霉病的發(fā)生率還不清楚,在一項大型研究中,Guinea等報道住院COPD患者下呼吸道標本曲霉檢

2、出率是1.6％,其中22.1％的患者臨床診斷為IPA。COPD患者合并曲霉感染的臨床特點及相關(guān)因素尚不明確,有關(guān)資料多來源于分散的病例報道或小規(guī)模的尸檢總結(jié)。目前推測大劑量使用糖皮質(zhì)激素、反復(fù)應(yīng)用廣譜抗生素、肺功能Ⅲ級以上、合并基礎(chǔ)疾病、營養(yǎng)不良等因素均可能增加COPD患者曲霉感染的風險,但這種推測缺乏大規(guī)模臨床研究來證實。COPD患者曲霉易感性增加的原因尚不清楚,可能與其呼吸系統(tǒng)防疫功能減退有關(guān)。健康者吸入曲霉孢子后,由于支氣管粘膜的

3、結(jié)構(gòu)及功能完整,纖毛運動可以將曲霉孢子清除出體外。COPD患者由于吸煙、感染等因素導(dǎo)致呼吸道上皮細胞受損,使吸入的曲霉孢子更容易粘附并侵入支氣管粘膜,到達深層組織造成感染。此外,有研究顯示煙霧暴露會損害肺內(nèi)的多種吞噬細胞,如巨噬細胞、中性粒細胞等正常防御功能,導(dǎo)致細菌在呼吸系統(tǒng)定植及感染增加。COPD患者曲霉感染的風險增高是否與肺內(nèi)吞噬細胞功能障礙有關(guān),目前未見相關(guān)實驗研究報道。
　　 本研究通過對比分析合并IPA的COPD患者

4、以及普通COPD患者臨床資料,探討COPD并發(fā)IPA的危險因素及臨床特點。此外,我們復(fù)制COPD大鼠模型,并以此為基礎(chǔ)開展相應(yīng)的實驗研究:通過體內(nèi)實驗,觀察COPD大鼠對氣道內(nèi)接種曲霉孢子清除能力的變化；體外實驗研究COPD大鼠肺泡巨噬細胞對曲霉孢子的吞噬能力及巨噬細胞釋放炎癥因子的特點；研究COPD大鼠肺泡巨噬細胞表面與曲霉防御相關(guān)受體的表達情況。
　　 研究方法：
　　 (一)慢性阻塞性肺病患者合并侵襲性肺曲霉病的臨

5、床特點和相關(guān)危險因素
　　 1、采用病例對照研究方法,收集2006年1月至2009年12月在我院診斷合并IPA的COPD患者30例,并選擇同期住院無真菌感染COPD患者60例作為對照,對患者基礎(chǔ)情況(年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史、合并基礎(chǔ)疾病、穩(wěn)定期糖皮質(zhì)激素治療情況、3個月內(nèi)抗生素使用情況、肺功能)和住院期間臨床資料(體溫、白細胞計數(shù)、血氣分析、血漿白蛋白、下呼吸道分泌物病原學(xué)檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果、機械通氣情況、抗生素及糖

6、皮質(zhì)激素使用情況、住院時間、轉(zhuǎn)歸)進行單因素及多因素回歸分析,以探討COPD合并IPA的臨床特點和相關(guān)危險因素。
　　 2、數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行處理:結(jié)果用均數(shù)±標準差或陽性病例數(shù)表示。分類變量應(yīng)用x2檢驗或fisher精確概率檢驗,連續(xù)變量用獨立樣本t檢驗或mann-whitney u檢驗。以P<0.05作為有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標準。多變量Logistic回歸分析用于尋找與COPD合并IPA相關(guān)的危險因素,單變

7、量分析中,P<0.2的變量被納入該分析。
　　 (二)慢性阻塞性肺病大鼠對曲霉防御功能的變化及機理
　　 1、COPD大鼠模型的構(gòu)建:采用煙熏+內(nèi)毒素滴入的方法,動物每天置于煙室內(nèi)三次,每次45分鐘,試驗組向煙室內(nèi)注入香煙煙霧,對照組注入空氣,共30天(第9、19天除外)。第9、19天試驗組氣道內(nèi)注入濃度為1mg/ml內(nèi)毒素200μl,對照組滴入等量生理鹽水。30天后處死動物,用病理評分的方法進行模型鑒定。
　　

8、 2、COPD大鼠對氣道內(nèi)接種曲霉孢子清除能力的研究:正常大鼠與COPD大鼠氣道內(nèi)滴入濃度為107/ml曲霉孢子混懸液200μl,接種后第1、3、5、7、14天處死動物,取0.5g肺組織勻漿后定量培養(yǎng)。
　　 3、COPD大鼠肺泡巨噬細胞對曲霉孢子吞噬功能的研究:分離大鼠肺泡巨噬細胞,加入煙曲霉孢子共培養(yǎng),用生物素-卡爾科弗盧爾染色法進行熒光染色,定量分析巨噬細胞對曲霉孢子的吞噬率及吞噬指數(shù)。用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中TNF

9、-α、MIP-2、IL—1β、IL-10的濃度。
　　 4、COPD大鼠肺泡巨噬細胞Dectin-1、TLR2受體的表達:分離大鼠肺泡巨噬細胞,用流式細胞技術(shù)檢測正常及COPD大鼠肺泡巨噬細胞表面Dectin-1、TLR2受體的表達情況,并將動物接種曲霉孢子,接種后第0、1、3、5、7、14天處死動物,檢測孢子刺激后肺泡巨噬細胞表面Dectin-1、TLR2受體表達的變化情況。
　　 5、數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件

10、包進行處理:結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。連續(xù)變量用獨立樣本t檢驗或mann-whitney u檢驗。多因素試驗資料采用析因設(shè)計的方差分析。以P<0.05作為有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標準。
　　 結(jié)果：
　　 (一)慢性阻塞性肺病患者合并侵襲性肺曲霉病的臨床特點和相關(guān)危險因素
　　 1、2006年1月至2009年12月我院共收治COPD患者992名,39(3.9％)例診斷為IPA,其中合并腫瘤4例,血液系統(tǒng)疾病2例,因類風濕

11、性關(guān)節(jié)炎使用免疫抑制劑3例,最終30例患者入選病例組。所有患者痰培養(yǎng)及涂片檢查均曲霉陽性,其中煙曲霉29例,黃曲霉1例。19例患者行血清GM抗原檢查,GM抗原檢查的陽性率為47.4％。病例組診斷IPA的時間為5～30d,存活的IPA患者平均診斷時間為11.5±5.1d,死亡患者為15.0±8.1d(P=0.19)。
　　 2、病例組及對照組在年齡、性別、體重指數(shù)及吸煙史等方面無差異。雖然病例組肺功能Ⅲ級以上的患者比例高于對照組,

12、但兩組患者的肺功能差異并未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.13)。病例組心血管疾病、糖尿病、及腎功能不全等并發(fā)疾病的發(fā)生率顯著高于對照組。入院前的治療情況兩組也存在顯著差異,特別是近三個月內(nèi)廣譜抗生素的使用,病例組為83.3％,對照組30％(P<0.001)。病例組患者穩(wěn)定期吸入糖皮質(zhì)激素的比例也高于對照組(50％vs.26.7％,P=0.28)。
　　 3、COPD合并IPA缺乏特異性癥狀,呼吸困難幾乎見于所有IPA患者(93.3％

13、vs.63.3％,P=0.002)。初始的胸片或CT檢查,兩組的影像學(xué)表現(xiàn)無顯著差異,病例組并未表現(xiàn)出特殊的影像學(xué)改變。但是動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),65.4％的IPA患者出現(xiàn)肺部病灶的進展,而對照組僅11.4％的患者出現(xiàn)這樣的情況(P<0.001)。病例組所有患者均使用了廣譜抗生素治療,且73.3％的患者先后使用了三種以上抗生素；對照組使用三種以上抗生素的僅8.3％(P<0.001)。入院后全身糖皮質(zhì)激素的使用率病例組顯著高于對照組(66.7％v

14、s.40％,P=0.017),且病例組26.7％的患者全身糖皮質(zhì)激素使用累積劑量大于700mg強的松,而對照組僅1.7％的患者達到這一劑量(P=0.001)。病例組需要機械通氣治療的患者比例顯著高于對照組(43.3％vs.5％,P<0.001)。
　　 4、多因素分析結(jié)果顯示基礎(chǔ)肺功能情況與入院前三個月使用抗生素之間存在交互效應(yīng),肺功能Ⅲ級或Ⅳ級的患者入院前使用廣譜抗生素發(fā)生IPA的風險將顯著增加(OR20.26),穩(wěn)定期全身使

15、用糖皮質(zhì)激素、住院期間使用三種以上抗生素、以及抗生素應(yīng)用時間大于10天是與IPA發(fā)生相關(guān)的獨立危險因素。
　　 (二)慢性阻塞性肺病大鼠對曲霉防御功能的變化及機理
　　 1、成功復(fù)制COPD模型:與對照組相比,模型組肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)明顯升高(P=0.005),中性粒細胞比例明顯升高(P=0.000),巨噬細胞比例降低(P=0.000),淋巴細胞比例兩組間無顯著差異(P=0.433)。鏡下見模型組支氣管纖毛柱狀上皮呈

16、鋸齒樣增生增厚,纖毛倒伏,上皮脫落,支氣管腔內(nèi)中性粒細胞及粘液蓄積,管壁結(jié)締組織增生,平滑肌增厚,可見單核細胞和淋巴細胞浸潤,支氣管周圍可見淋巴小結(jié)。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁變薄、斷裂,肺泡腔擴大,部分融合成肺大皰。模型組及對照組支氣管炎癥評分分別為3.84±0.92、1.04±0.48(P=0.000)。模型組平均肺泡間隔明顯高于對照組,分別為161.67±21.63μm、90.07±13.58μm(P=0.000)。
　　 2、

17、肺組織定量培養(yǎng)結(jié)果表明,隨時間延長,接種曲霉孢子動物肺內(nèi)曲霉負荷均逐漸降低,但正常組下降更為顯著,除第7天外其他各時間點COPD大鼠肺內(nèi)曲霉負荷顯著高于對照組(P<0.05)。病理切片PAS染色,各組肝、脾、腎、胰腺等組織結(jié)構(gòu)正常,未見曲霉感染。接種后第14天正常大鼠肺組織病理片中僅見個別孢子殘留,而COPD組肺組織內(nèi)仍可見較多孢子殘留。
　　 3、熒光染色法能明確區(qū)分巨噬細胞細胞內(nèi)外的孢子。對照組與COPD組肺泡巨噬細胞對曲霉

18、孢子的吞噬率存在顯著差異,分別為50.6％±14.7％和25.8％±4.2％(P=0.048)。對照組AM對曲霉孢子的吞噬指數(shù)為3.1±0.8,高于COPD組(2.5±0.8),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.380)。
　　 4、基礎(chǔ)狀態(tài)下,兩組培養(yǎng)上清中的TNF-α、MIP-2、IL-1β、IL-10的濃度均較低,但COPD組TNF-α及MIP-2的濃度顯著高于對照組(P<0.05)。曲霉孢子刺激2h后,兩組培養(yǎng)上清中相應(yīng)細胞因

19、子濃度均顯著升高,但正常組各細胞因子的終濃度均顯著高于COPD組(P<0.05)。
　　 5、COPD大鼠肺泡巨噬細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下細胞膜表面Dectin-1受體表達較正常對照組顯著降低(P=0.017)；曲霉孢子刺激后,兩組肺泡巨噬細胞表面Dectin-1受體表達均增強,陽性細胞比例隨刺激時間延長均逐漸升高,第5天達最高峰后回落,統(tǒng)計分析表明COPD組與對照組AM中Dectin-1陽性細胞百分比變化趨勢一致。
　　 6、

20、COPD大鼠肺泡巨噬細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下細胞膜表面TLR2受體表達較正常對照組顯著降低(P=0.032)；曲霉孢子刺激后,兩組肺泡巨噬細胞表面TLR2受體表達均增強,陽性細胞比例隨刺激時間延長均逐漸升高,以對照組變化更加明顯(50.4%±14.6％vs.28.0%±4.1％),第5天達最高峰,均為70％以上,隨后回落,統(tǒng)計分析表明COPD組與對照組AM中TLR2陽性細胞百分比變化趨勢不一致,COPD組TLR2受體陽性細胞比例上升速度低于對照

21、組。
　　 結(jié)論：
　　 1、COPD患者并發(fā)IPA后病情危重,機械通氣比例顯著增高,住院時間延長,死亡率增加。穩(wěn)定期全身使用糖皮質(zhì)激素、住院期間使用三種以上抗生素、以及抗生素使用時間大于10d是與IPA發(fā)生相關(guān)的獨立危險因素。COPD患者出現(xiàn)嚴重呼吸困難、抗生素抵抗的下呼吸道感染、痰中反復(fù)檢出曲霉菌,應(yīng)考慮到IPA的可能,要及時予以針對性的檢查及治療。
　　 2、COPD大鼠肺泡巨噬細胞對曲霉孢子的吞噬能力以及