干預(yù)腦出血術(shù)后鐵超載的角蛋白凝膠構(gòu)建及性能研究.pdf

1、腦出血是致殘率和致死率較高的疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。腦出血發(fā)生后會(huì)在腦組織內(nèi)形成血腫，誘發(fā)原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷。對(duì)于出血量較大的腦出血患者（>30mL），首選治療方式為手術(shù)治療，通過(guò)手術(shù)清除血腫，可降低顱內(nèi)壓，減輕或者避免血腫對(duì)神經(jīng)組織的壓迫。但目前無(wú)論采取何種入顱手術(shù)，在臨床上都無(wú)法將血腫完全清除。殘留血腫內(nèi)紅細(xì)胞裂解后會(huì)釋放出大量血紅蛋白，經(jīng)血紅素降解，產(chǎn)生一氧化碳、鐵離子和膽紅素等物質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷。其中，鐵離子作為紅細(xì)

2、胞主要的降解產(chǎn)物，會(huì)大量聚集于腦組織，呈現(xiàn)過(guò)載現(xiàn)象，過(guò)載的鐵離子催化過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，進(jìn)而攻擊細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸，造成細(xì)胞死亡。因此，通過(guò)干預(yù)腦出血術(shù)后鐵超載有望提高其治療效果。
　　本課題基于影響腦出血手術(shù)治療效果的術(shù)后鐵超載，構(gòu)建了載鐵離子螯合劑的角蛋白凝膠作為術(shù)后的原位治療藥物。該凝膠在血腫清除手術(shù)后植入腦內(nèi)，不僅可以通過(guò)凝膠吸附作用快速吸附殘留血腫組織周圍的過(guò)載鐵離子，還可以釋放包埋的藥物對(duì)鐵離子進(jìn)行螯合，從而通過(guò)消除

3、鐵超載，緩解腦出血術(shù)后的繼發(fā)性腦損傷，可為腦出血的輔助性治療提供一種新的治療理念和策略。
　　本課題的主要研究?jī)?nèi)容和相應(yīng)結(jié)果如下：
　?、俨捎醚趸◤娜祟^發(fā)中提取氧化型角蛋白，作為藥物載體的原材料。得到人頭發(fā)角蛋白提取率為3.52±0.56％。應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)角蛋白的分子量進(jìn)行分析，得頭發(fā)角蛋白多肽片段主要分為兩部分，一部分大量聚集于40-60KD，主要為α角蛋白，另一部分少量聚集于10-15KD處，主要為γ

4、角蛋白，根據(jù)電泳結(jié)果可知，該角蛋白混合物以α角蛋白為主。應(yīng)用氨基酸分析儀對(duì)角蛋白進(jìn)行了氨基酸分析，所得角蛋白中一共被檢測(cè)出17種氨基酸，總含量占角蛋白總質(zhì)量的64.50±4.08%，除色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺之外，所有氨基酸均被檢測(cè)到，含量最高的為谷氨酸和精氨酸，分別占角蛋白質(zhì)量的11.08±1.15%和7.01±0.57%，含量最低的為蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸以及賴氨酸，含量分別占0.61±0.15%，1.03±0.06%，1.68

5、±0.14%和1.93±0.41%。組成角蛋白的氨基酸中二硫鍵含量較低，所含極性親水性氨基酸較多，表明角蛋白具有較高的親水性。
　?、诓捎梦锢斫宦?lián)法制備了空白角蛋白凝膠，并通過(guò)其鐵離子吸附性能考察了角蛋白凝膠濃度對(duì)鐵離子吸附性能的影響，得出結(jié)論為：濃度為30%的角蛋白凝膠具有最佳的鐵離子吸附能力。前120min吸附最快，鐵離子清除率達(dá)到27.47±1.71%，120-360min時(shí)間內(nèi)，鐵離子濃度下降較為平緩，凝膠的吸附率為4.6

6、4±0.49μg/mg，360min以后，鐵離子濃度和凝膠吸附率皆趨于穩(wěn)定。接著對(duì)空白角蛋白凝膠進(jìn)行了鐵離子吸附動(dòng)力學(xué)擬合，通過(guò)對(duì)比，其吸附行為更符合二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)。運(yùn)用Weber-Morris內(nèi)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模型對(duì)凝膠的鐵離子吸附行為進(jìn)行研究，結(jié)果表明影響凝膠吸附性能的因素包括溶液中外部質(zhì)量傳遞與內(nèi)擴(kuò)散，兩者共同影響凝膠對(duì)鐵離子的吸附。通過(guò)SEM，F(xiàn)T-IR，以及XRD對(duì)角蛋白進(jìn)行表征，結(jié)果表明凝膠具有較好的孔隙度，孔徑大小為20-100

7、μm，大量的孔徑有利于藥物的裝載和鐵離子的吸附。XRD和FT-IR結(jié)果表明，凝膠對(duì)鐵離子吸附成功。
　　③采用共沉積法制備出載鹽酸米諾環(huán)素角蛋白凝膠。體外釋藥擬合結(jié)果顯示，藥物主要以擴(kuò)散方式進(jìn)行的釋放。凝膠載藥量對(duì)其鐵離子螯合性能影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載藥量為12%的載藥凝膠具有較好的鐵離子螯合能力，前120min螯合較快，鐵離子清除率達(dá)到44.16±2.35%，凝膠吸附率增長(zhǎng)較快，為5.18±0.24μg/mg；120-360mi

8、n時(shí)間內(nèi)，鐵離子螯合速度降低，凝膠吸附率增長(zhǎng)緩慢，360min時(shí)，鐵離子清除率為59.70±3.37%；360min以后，由于藥物全部釋放，鐵離子的螯合速度減慢，720min時(shí)刻，鐵離子清除率為62.38±4.14%，凝膠吸附率為7.20±0.50μg/mg。同樣使用SEM，F(xiàn)T-IR以及XRD對(duì)載藥凝膠進(jìn)行表征，表明藥物包埋過(guò)程為物理過(guò)程。
　?、苓M(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)考察載藥角蛋白凝膠對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性以及神經(jīng)保護(hù)性能。當(dāng)凝膠濃度增

9、大到200μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降，當(dāng)濃度持續(xù)增高到800μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率降低至51.55±10.09%（P<0.01），結(jié)果表明載藥角蛋白凝膠具有輕微的細(xì)胞毒性。通過(guò)向培養(yǎng)液中加入血紅素（25μM）造成細(xì)胞鐵毒性，經(jīng)載藥凝膠孵育受損細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率隨著凝膠濃度升高逐漸增高，當(dāng)凝膠濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，與對(duì)照組（50.88±15.62%）相比，細(xì)胞存活率增至94.22±8.57%，表明角蛋白凝膠對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有