雌激素膜受體GPER1對心肌氧化損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　在我國，缺血性心臟病的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害人民群眾健康。冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致的動脈狹窄或閉塞是引起缺血性心臟病最主要的原因。通過經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)或冠狀動脈搭橋術(shù)迅速恢復(fù)心肌供血是治療缺血性心臟病的關(guān)鍵。但是，冠狀動脈再灌注常常導(dǎo)致心功能不全，包括心律失常，微血管損傷，心肌細(xì)胞死亡等，臨床上把這種現(xiàn)象稱為心肌缺血/再灌注損傷。抑制心肌缺血/再灌注損傷是續(xù)解除冠狀動脈狹窄或阻塞后，缺血性心肌病重要的治療策略。

2、因此，開發(fā)安全、高效的防治心肌缺血/再灌注損傷的藥物具有十分重要的臨床意義。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)缺血性心臟病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與性別存在明顯的相關(guān)性。男女體內(nèi)激素水平特別是性激素水平不同是導(dǎo)致缺血性心臟病存在性別差異的最主要原因。雌激素是女性體內(nèi)一種非常重要的性激素。實驗室研究已證實雌激素對心肌缺血損傷有保護作用，但是，在雌激素替代療法治療冠心病的臨床研究中，雌激素并沒有表現(xiàn)出令人驚喜的心肌保護作用，這導(dǎo)致人們對雌激素是否具有心肌保護作用產(chǎn)

3、生較大爭論。因此，深入探討雌激素心肌保護效應(yīng)和相關(guān)分子機制是解決上述爭論迫切需要的。
　　GPER1是目前唯一被廣泛認(rèn)可的雌激素相關(guān)膜受體。GPER1的發(fā)現(xiàn)為研究雌激素心肌保護效應(yīng)，提供了一個新的靶點。當(dāng)前，已有研究顯示GPER1在人體和動物心臟高表達(dá)，并且GPER1的表達(dá)量明顯高于雌激素α和β兩個核受體?；罨疓PER1能夠縮小心肌梗死面積，提高心臟功能。在敲出GPER1基因的小鼠中，雌激素失去對缺血心肌的保護作用。這些研究提示G

4、PER1在雌激素介導(dǎo)的缺血心肌保護中起著決定性的作用。當(dāng)前，人們對于GPER1心肌保護效應(yīng)的觀察并不全面，對于GPER1如何參與心肌保護作用的分子機制尚不清楚。這些都成為以GPER1為靶點開發(fā)安全、高效的防治心肌缺血/再灌注損傷藥物的“絆腳石”。氧化應(yīng)激是缺血/再灌注導(dǎo)致心肌損傷的重要原因。因此，本研究采用雙氧水（H2O2）處理心肌細(xì)胞建立心肌氧化損傷模型，全面觀察GPER1對大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷的保護作用，并探討相關(guān)分子機制。本研究旨

5、在為以GPER1為靶點研制防治心肌缺血/再灌注損傷藥物提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。同時，本研究的完成也深化了我們對雌激素心肌保護機制的認(rèn)識。
　　目的：
　　1、明確GPER1對H2O2導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷的保護作用，并探討GPER1介導(dǎo)心肌保護的能力與它被活化程度以及被活化時間點的關(guān)系。
　　2、觀察GPER1能否抑制H2O2導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，并進一步探討GPER1通過活化Akt，抑制ASK1-MKK3/6-p38信號通

6、路，最終抑制細(xì)胞凋亡的機制。
　　3、觀察 GPER1能否抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，并進一步探討 GPER1通過活化Akt，上調(diào)Nrf2表達(dá)，提高心肌細(xì)胞抗氧化能力，從而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激的機制。
　　方法：
　　1、新生SD雄性大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)在無菌條件下迅速取出新生SD雄性大鼠心臟，除去心房和大血管，獲得心室，將心室剪碎成約1-2 mm3小塊；加入0.1％膠原酶室溫消化10 min，然后加入培養(yǎng)基（含10%胎牛血

7、清的高糖DMEM）終止消化，靜止片刻收集細(xì)胞懸液，按上述步驟重復(fù)消化心室組織碎塊3次。收集細(xì)胞懸液，用200目篩網(wǎng)過濾，然后1000轉(zhuǎn)/min，離心5 min，去除上清液，培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）重懸沉淀，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)30 min，去除成纖維細(xì)胞。輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，小心吸出細(xì)胞混懸液，接種于培養(yǎng)皿中，入細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)（培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2）。隔天換1次液，培養(yǎng)3-4天后使用。
　　2、實驗分組

8、將原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞分為4個大組，正常組，H2O2處理組， G1處理組，G1+抑制劑組（G15或LY294002）處理組。后三個組根據(jù)實驗設(shè)計又分為若干個小組。在H2O2處理心肌細(xì)胞建立氧化損傷模型實驗中，根據(jù)處理細(xì)胞H2O2濃度（400-1200μM），細(xì)胞分為：400μM，600μM，800μM，1000μM，1200μM共五個組。在觀察 GPER1對心肌細(xì)胞氧化損傷保護作用的研究中，G1處理組根據(jù)給藥時間，分為H2O2處理前1h組，

9、H2O2處理后20 min和H2O2處理后1h組；G1處理組根據(jù)給藥濃度，分為1,4,6,8,10 nM五組。在GPER1心肌保護機制研究中，G1處理組給藥時間為H2O2處理前1h；給藥濃度：8 nM。抑制劑G15和LY294002給藥時間為給予G1前1h，給藥濃度：G15(100 nM)和 LY294002(10μM)。
　　3、心肌cTnT和GPER1免疫熒光雙標(biāo)染色心肌細(xì)胞爬片用4℃，4%多聚甲醛在室溫固定20min。然后，

10、5%山羊血清室溫孵育30 min，0.5%Triton X-100室溫孵育15 min，用抗cTnT抗體（抗體濃度1:100）4℃條件下孵育細(xì)胞過夜。PBS緩沖液洗滌三次，用Cy3（紅色熒光）標(biāo)記的二抗37℃條件下孵育細(xì)胞2 h。PBS緩沖液洗滌三次，用抗GPER1抗體（抗體濃度1:100）4℃條件下孵育細(xì)胞過夜。PBS緩沖液洗滌三次，用FITC（綠色熒光）標(biāo)記的二抗37℃條件下孵育細(xì)胞2 h。最后，DAPI染色液室溫孵育細(xì)胞10 mi

11、n。防熒光淬滅封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的染色情況。
　　4、心肌細(xì)胞細(xì)胞活力檢測（MTT法）將心肌細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板中，每組4個復(fù)孔，每孔培養(yǎng)基180μl，置于37℃，5%CO2孵箱中24h。按實驗要求處理心肌細(xì)胞后，在培養(yǎng)基中加入5mg/ml MTT20μl/孔，置于37℃，5%CO2孵箱孵育4h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150μl DMSO，搖床緩慢振搖10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測定

12、吸光度(OD)值。
　　5、Hoechst33342染色按實驗要求處理心肌細(xì)胞后，取出細(xì)胞爬片，4%的4℃多聚甲醛室溫固定20 min，10 mg/ml Hoechst33342染液染色（染色條件：37℃，10min），PBS洗三遍，熒光微鏡觀察結(jié)果。
　　6、心肌細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL染色法）細(xì)胞按照實驗設(shè)計被處理后，用4.0%多聚甲醛固定20 min，20μg/ml蛋白酶K消化15 min；0.3%H2O2室溫處理20

13、 min；標(biāo)記緩沖液(含0.03U/μl TdT和0.04 nmol/μl生物素-11-dUTP)濕盒中37℃孵育60 min；PBS沖洗3次，DAPI復(fù)染核。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的情況。
　　7、心肌細(xì)胞 cleaved caspase-3免疫熒光染色心肌細(xì)胞按實驗設(shè)計處理結(jié)束后，取出細(xì)胞爬片，PBS洗三遍，4%的4℃多聚甲醛室溫固定20 min，0.5% Triton X-100通透15 min，山羊血清封閉30 min，

14、PBS洗三遍。cleaved caspase-3抗體（1：:100）4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，PBS洗三遍，二抗（FITC）室溫2 h(避光)， PI染核，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。
　　8、Western blot檢測實驗處理后心肌細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3和Nrf2表達(dá)水平以及Akt和ASK1-MKK3/MKK6-p38信號通路中的分子磷酸化水平心肌細(xì)胞按實驗設(shè)計處理結(jié)束后，提取心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白，BCA法測定蛋

15、白濃度，蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉2h, TBST洗3次，每次10min；相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，洗膜3次，每次10min；加入二抗封袋，搖置2h；洗膜3次，每次10min；洗滌后用增強型化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯色后，利用 Quantity One軟件采集圖像并進行灰度值分析。
　　9、心肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基檢測心肌細(xì)胞按實驗設(shè)計處理后，各組細(xì)胞被30μM DCF-DA孵育30 mi

16、n（培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2），PBS洗三遍，激光共聚焦顯微鏡觀察載玻片上細(xì)胞的DCF熒光強弱，6孔板內(nèi)細(xì)胞被胰酶消化后，流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞平均DCF熒光密度。
　　10、心肌細(xì)胞總抗氧化力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量測定心肌細(xì)胞被接種于6孔板中，培養(yǎng)3天后，按實驗設(shè)計處理各組細(xì)胞。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用4℃PBS洗三遍，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解，4℃離心，取上清待測。參照試劑盒說明書測

17、定心肌細(xì)胞T-AOC、SOD活性及MDA含量。
　　結(jié)果：
　　1、原代培養(yǎng)的SD雄性乳鼠心肌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GPER1，使用G1（GPER1激動劑）活化GPER1抑制H2O2導(dǎo)致的心肌細(xì)胞活力下降，并且G1對心肌細(xì)胞的保護作用有明顯的劑量依賴性和時間依賴性。G15（GPER1拮抗劑）可以阻斷G1對H2O2處理心肌細(xì)胞的保護作用。H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞caspase-3活化和細(xì)胞凋亡，使用G1激活GPER1顯著抑制H2O2處理后心

18、肌細(xì)胞caspase-3活化和細(xì)胞凋亡，G15可以阻斷G1的上述效應(yīng)。
　　2、H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞p38磷酸化，并且隨著H2O2處理心肌細(xì)胞時間的延長，心肌細(xì)胞內(nèi)p38的磷酸化水平越高。SB203580（一種選擇性的p38抑制劑）抑制H2O2導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力下降和caspase-3活化。上述結(jié)果表明，p38的激活參與了H2O2導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。進一步，使用G1活化GPER1顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞p38磷酸化，減少細(xì)胞內(nèi)

19、cleaved caspase-3水平，提高細(xì)胞活力。而GPER1的抑制劑G15可以阻斷G1的上述效應(yīng)。這些結(jié)果表明GPER1通過抑制p38的激活保護H2O2導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。
　　3、H2O2處理后，心肌細(xì)胞中Akt的磷酸化水平和ASK1在絲氨酸83位點的磷酸化水平均顯著下降。活化GPER1顯著增加H2O2處理后心肌細(xì)胞中Akt和ASK1在絲氨酸83位點磷酸化水平，但G15和LY294002能抑制G1的這種效應(yīng)。這些結(jié)果表明，

20、在處于氧化應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞中，GPER1可以活化Akt，活化的Akt使ASK1的絲氨酸83位點磷酸化，使ASK1失活。H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞MKK3和MKK6磷酸化，隨著H2O2處理心肌細(xì)胞時間的延長，心肌細(xì)胞內(nèi)MKK3和MKK6的磷酸化水平越高。使用G1活化GPER1能顯著增加ASK1在絲氨酸83位點磷酸化水平，抑制MKK3，MKK6和p38的磷酸化水平。這些結(jié)果表明，GPER1通過抑制ASK1活性，從而抑制MKK3，MKK6和p38

21、的活化，即GPER1抑制H2O2誘導(dǎo)ASK1-MKK3/6-p38信號通路活化。
　　4、H2O2處理后，大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強度明顯升高，G1能顯著抑制H2O2處理后心肌細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強度的升高，但G1的這種效應(yīng)能被G15拮抗。H2O2導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)T-AOC和SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，而G1能顯著提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞內(nèi)T-AOC和SOD活性，減少MDA含量，但上述這些效應(yīng)能被G15拮抗。這些實驗結(jié)

22、果證實活化的GPER1通過提高心肌細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力，抑制氧自由基產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化損傷。
　　5、G1可以顯著增加氧化應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞中Akt的磷酸化和核內(nèi)Nrf2蛋白的水平。G15可以阻斷G1對Akt的磷酸化和核內(nèi)Nrf2表達(dá)的增加。更重要的是LY-294002（IP3K抑制劑）也能阻斷G1對Akt的磷酸化和核內(nèi)Nrf2表達(dá)的增加。這些實驗結(jié)果表明在心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活化的GPER1可以激活PI3K/Akt信號通路

23、，進而促進細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)的增加。
　　結(jié)論：
　　1、活化GPER1能夠保護心肌細(xì)胞抵抗H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降，但其心肌保護能力與它被活化的程度以及活化的時間點有關(guān)。GPER1抑制H2O2導(dǎo)致的心肌細(xì)胞caspase-3活化和細(xì)胞凋亡是GPER1心肌保護作用的一個重要的機制。
　　2、活化GPER1使心肌細(xì)胞中Akt活性增加，促進ASK1絲氨酸83位點磷酸化，使ASK1活性下降，進而抑制H2O2活化的ASK1