SIRT3對(duì)小鼠心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝障礙及纖維化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　論文Ⅰ SIRT3對(duì)小鼠心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝障礙的影響及其機(jī)制研究
　　研究目的:
　　1.探討SIRT3在心肌肥厚中是否具有保護(hù)作用。
　　2.探討SIRT3對(duì)心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝的影響。
　　3.研究過(guò)表達(dá)SIRT3是否能夠減輕肥厚心肌細(xì)胞中脂質(zhì)累積。
　　研究方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
　　所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合國(guó)家衛(wèi)生部動(dòng)物管理辦法（文案號(hào)

2、No.55，2001）和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。SIRT3-KO小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，6-7周齡雄性129野生型小鼠購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物研究所。
　　2.構(gòu)建小鼠心肌肥厚模型:
　　我們給予8周齡雄性小鼠（年齡匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠）以胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC)。我們采用戊巴比妥鈉對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，將胸主動(dòng)脈從周圍組織中分離出來(lái)，于兩側(cè)頸總動(dòng)脈之間放置27號(hào)空針針頭(27-gau

3、ge needle)然后進(jìn)行手術(shù)縫線結(jié)扎，迅速將針頭移除。除結(jié)扎外，假手術(shù)組動(dòng)物被給予相同處理。所有動(dòng)物在術(shù)后6周處死，將小鼠心臟取材進(jìn)行肥厚指標(biāo)和脂質(zhì)分析等方面的研究。
　　3.免疫組織化學(xué):
　　取材后，組織切片進(jìn)行HE染色觀察形態(tài)，進(jìn)行Masson染色來(lái)評(píng)估膠原含量。膠原含量采用自動(dòng)圖像分析軟件(Image Pro Plus)進(jìn)行定量分析。
　　4.超聲心動(dòng)圖:
　　采用VisualSonics Vevo7

4、70小動(dòng)物超聲進(jìn)行左室長(zhǎng)軸測(cè)量，分別采用M-mode、二維超聲心動(dòng)圖(2-D)、脈沖多普勒超聲(Pulse Wave Doppler， PWD)等模式進(jìn)行圖形采集并分析。
　　研究結(jié)果:
　　1.SIRT3在小鼠肥厚心肌中表達(dá)降低
　　我們給予小鼠TAC術(shù)，并觀察6周。為確保主動(dòng)脈結(jié)扎成功，我們利用超聲心動(dòng)圖探查主動(dòng)脈結(jié)扎部位并測(cè)量其血流速度。我們通過(guò)計(jì)算小鼠心重與體重比值，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟在結(jié)扎2周、4周、6周后分別產(chǎn)生

5、20％、40％、60％的心肌肥厚。此外，我們發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，短片段SIRT3在TAC術(shù)后明顯降低;而長(zhǎng)片段SIRT3在輕度肥厚時(shí)輕度上升，在嚴(yán)重肥厚時(shí)并無(wú)明顯表達(dá)變化。這些結(jié)果與Sundaresan等在類似心肌肥厚疾病模型中獲得的結(jié)論一致，證實(shí)了短片段的去乙?；鞍譙IRT3在小鼠肥厚心肌中表達(dá)降低。
　　2.SIRT3-KO小鼠在TAC術(shù)后易于形成心肌肥厚
　　為進(jìn)一步研究SIRT3在心肌肥厚中所起的作用，我們給與SI

6、RT3-KO小鼠及野生型小鼠TAC術(shù)。我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，SIRT3-KO小鼠TAC術(shù)后肥厚程度更加嚴(yán)重(15％)。在假手術(shù)組，SIRT3-KO小鼠亦出現(xiàn)比野生型小鼠更高的心重體重比。組織學(xué)檢查顯示，無(wú)論在TAC還是假手術(shù)組，SIRT3-KO小鼠心肌中表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的細(xì)胞壞死和心肌纖維化。我們利用超聲心動(dòng)圖對(duì)小鼠心臟進(jìn)行無(wú)創(chuàng)評(píng)價(jià):SIRT3-KO小鼠左室后壁在基礎(chǔ)水平及TAC術(shù)后均較野生型小鼠更厚。此外，左室短軸縮短率(Fract

7、ion Shortening，F(xiàn)S)分析顯示SIRT3-KO小鼠更加容易形成嚴(yán)重收縮功能障礙。這些研究發(fā)現(xiàn)SIRT3-KO小鼠在TAC術(shù)后易于出現(xiàn)心臟功能受損及心力衰竭，提示SIRT3在心肌肥厚的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　3.SIRT3-KO小鼠心肌中出現(xiàn)過(guò)度脂質(zhì)積累及脂肪酸氧化速率降低
　　我們利用透射電子顯微鏡觀察小鼠肥厚心肌，結(jié)果顯示肥厚心肌中線粒體形態(tài)出現(xiàn)嚴(yán)重病變。SIRT3-KO在正常情況下未表現(xiàn)出明顯的心肌表型變

8、化;野生型和SIRT3-KO小鼠在TAC術(shù)后出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)累積;但是與野生型小鼠相比，SIRT3-KO小鼠出現(xiàn)更明顯的線粒體腫脹，線粒體嵴紊亂以及線粒體內(nèi)出現(xiàn)大量的泡沫。我們運(yùn)用其他代謝學(xué)檢測(cè)方法對(duì)小鼠心肌檢查后發(fā)現(xiàn)，甘油三酯及膽固醇水平在TAC術(shù)后均升高，在SIRT3-KO小鼠心肌中甘油三酯升高的更加明顯，提示心肌細(xì)胞脂肪酸氧化功能受損，同時(shí)驗(yàn)證了電鏡掃描結(jié)果。為了直接評(píng)估脂肪酸氧化能力，我們利用棕櫚酸氧化率進(jìn)行測(cè)算。在野生型小鼠中，

9、棕櫚酸氧化率降低30％，而在SIRT3-KO小鼠中，棕櫚酸氧化率在正常和肥厚狀態(tài)下均明顯降低。總之，結(jié)果顯示SIRT3-KO小鼠在心肌肥厚刺激后出現(xiàn)過(guò)度脂質(zhì)累積和脂肪酸氧化率降低。
　　結(jié)論:
　　1.SIRT3具有減輕心肌肥厚反應(yīng)的作用。
　　2.SIRT3可以改善心肌肥厚中線粒體脂質(zhì)代謝障礙。
　　3.SIRT3可以通過(guò)調(diào)節(jié)LCAD乙?；癄顟B(tài)改善心肌細(xì)胞線粒體脂肪酸氧化。
　　論文Ⅱ SIRT3激活對(duì)小

10、鼠心肌肥厚中纖維化的影響及機(jī)制研究
　　研究目的:
　　1.探討SIRT3對(duì)壓力超負(fù)荷引起的心肌纖維化的影響。
　　2.研究白藜蘆醇對(duì)小鼠心肌中SIRT3表達(dá)水平的影響。
　　3.探討SIRT3激活通過(guò)何種途徑減輕心肌纖維化。
　　研究方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
　　所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定和國(guó)家衛(wèi)生部動(dòng)物管理辦法（文案號(hào)No.55，2001）。6-7周

11、齡雄性129野生型小鼠購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物研究所，SIRT3-KO小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。
　　2.動(dòng)物飲食:
　　我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中給予動(dòng)物熱量攝入限制飲食(CR)，普通對(duì)照飲食(ControlDietary，CD)及白藜蘆醇補(bǔ)充飲食(RSV supplemental，RSV)。根據(jù)AIN-93M(BioServ，F(xiàn)renchtown，NJ)飲食推薦，我們給予CD組小鼠每周86.4 kcal的食物熱量供應(yīng)，給予CR組小鼠每

12、周64.8 kcal的食物熱量供應(yīng)。RSV組小鼠給予普通對(duì)照飲食加1.8mg/kg/天的含RSV的飼養(yǎng)用水供應(yīng)。
　　3.構(gòu)建小鼠心肌纖維化模型:
　　我們采用胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC)建立8周齡雄性小鼠（年齡匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠）反應(yīng)性心肌纖維化動(dòng)物模型。我們采用戊巴比妥鈉對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，將胸主動(dòng)脈從周圍組織中分離出來(lái)，將27號(hào)空針針頭(27-ga ugeneedle)放置于兩側(cè)頸總動(dòng)脈之間，然后進(jìn)行手術(shù)縫

13、線結(jié)扎，迅速將針頭移除。除結(jié)扎外，假手術(shù)組動(dòng)物被給予相同處理。所有動(dòng)物在術(shù)后8周處死，將小鼠心臟取材進(jìn)行肥厚和纖維化等方面的研究。
　　研究結(jié)果:
　　1.RSV可升高小鼠心肌SIRT3表達(dá)水平
　　我們給予野生型小鼠組熱量攝入限制飲食(CR)和白藜蘆醇補(bǔ)充飲食(RSV)8周，發(fā)現(xiàn)CR組心肌組織內(nèi)SIRT3表達(dá)水平較對(duì)照組升高1倍以上(*p＜0.05)。此外，白藜蘆醇干預(yù)(RSV，1.8 mg·kg-1·day-1)可

14、以引起與CR作用類似的SIRT3表達(dá)水平升高。隨后，我們給予野生型小鼠組及SIRT3-/-小鼠組TAC術(shù)及假手術(shù)組處理（小鼠按不同進(jìn)食方式進(jìn)行喂養(yǎng)直至安樂(lè)死）。在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到SIRT3在TAC術(shù)后水平降低50％，而白藜蘆醇干預(yù)可維持小鼠心肌內(nèi)SIRT3的表達(dá)水平。
　　2.白藜蘆醇抗心肌肥厚作用依賴于SIRT3參與
　　根據(jù)心重/體重比值測(cè)量，SIRT3-/-小鼠組在壓力超負(fù)荷刺激下產(chǎn)生更加嚴(yán)重的心肌肥厚（73％ in

15、SIRT3 KO+vehicle+TAC組;32％ in WT+vehicle+TAC組，*p＜0.05），白藜蘆醇干預(yù)可減輕野生型小鼠組心肌肥厚狀態(tài)，但在SIRT3-/-小鼠組未起到保護(hù)作用。白藜蘆醇干預(yù)可以降低其他心肌肥厚標(biāo)志物水平，如ANP，Myh-7，但在SIRT3-/-小鼠組未能降低此類胎性基因表達(dá)，上述結(jié)果提示白藜蘆醇改善心肌肥厚作用依賴于SIRT3參與。
　　3.白藜蘆醇激活SIRT3可以改善心肌舒縮功能
　　

16、我們對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，結(jié)果顯示在壓力超負(fù)荷刺激下，SI RT3-/-小鼠組左室后壁厚度較野生型小鼠組更加肥厚（1.45±0.07 mm，*p＜0.05）。左室短軸縮短率在TAC術(shù)后明顯降低，尤其在SIRT3-/-組，但左室射血分?jǐn)?shù)在兩組間無(wú)明顯差別。在我們的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)壓力超負(fù)荷容易造成心臟舒張功能異常，其中Aa速度升高及Ea/Aa比值降低均提示舒張功能減低。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，SI RT3-/-小鼠組及野生型小鼠組在TAC術(shù)

17、后舒張功能均下降，尤其在SIRT3-/-小鼠中更為明顯。白藜蘆醇可以改善野生型小鼠組心臟舒張功能，但在SIRT3-/-小鼠組未起到明顯改善作用。上述研究證實(shí)白藜蘆醇激活SIRT3可以改善心肌功能，尤其是舒張功能。
　　結(jié)論:
　　1.SIRT3激活可抑制心肌纖維化及心臟功能減低
　　2.白藜蘆醇可升高小鼠心肌內(nèi)SIRT3表達(dá)水平。
　　3.SIRT3的抗心肌纖維化作用依賴于對(duì)TGF-β/SMAD3通路的抑制作用。