脂聯(lián)素及其受體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶活性差異調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　隨著心血管疾病所導(dǎo)致的病死率不斷增加，心血管系統(tǒng)疾病已經(jīng)成為全球威脅人類健康的“全民公敵”。血管內(nèi)皮具有內(nèi)分泌和代謝功能，大量的研究證明，許多心血管疾病都有危險(xiǎn)因子作用于血管內(nèi)皮，進(jìn)一步研究表明，內(nèi)皮功能紊亂可由一氧化氮（NO）釋放減少或破壞增多等其他原因造成，其原因可能是精氨酸（Arg）缺乏、一氧化氮合酶（NOS）生成或磷酸化異常。內(nèi)皮的正常功能破壞，可使血管收縮舒張調(diào)節(jié)介質(zhì)、凝血系統(tǒng)因子、促生長(zhǎng)介質(zhì)之間的功能紊亂，

2、因此成為了心血管系統(tǒng)疾病一致的發(fā)生發(fā)展基礎(chǔ)[1]。
　　脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）作為一種脂肪細(xì)胞因子，研究證明脂聯(lián)素具有加速脂肪酸氧化,促進(jìn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)及降低肝糖輸出，對(duì)抗血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能等作用[2]。此外,在冠心病及其他大血管病變中發(fā)現(xiàn)血漿脂聯(lián)素水平明顯降低,這提示脂聯(lián)素與心血管病變密切相關(guān)。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，APN基因敲除（APN-/-）小鼠可導(dǎo)致嚴(yán)重的血管功能失調(diào)[3]，如對(duì)乙酰膽堿的

3、反應(yīng)性舒張存在嚴(yán)重敏感性降低、血管內(nèi)膜增厚等，這些癥狀給予APN之后可顯著改觀。但是，脂聯(lián)素對(duì)內(nèi)皮舒張反應(yīng)性調(diào)節(jié)的具體機(jī)制并不清楚；并且脂聯(lián)素及其受體如何調(diào)節(jié)其下游信號(hào)通路及機(jī)制也需進(jìn)一步的研究證實(shí)。與此同時(shí)，有研究表明，窖蛋白1（Caveolin-1）存在腳手架結(jié)構(gòu)，可與eNOS相互作用，從而改變NO的釋放，影響血管舒張功能。但是，脂聯(lián)素對(duì)血管舒張功能的調(diào)節(jié)與Caveolin-1是否有關(guān)，尚無(wú)定論。
　　為此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：（1

4、）應(yīng)用脂聯(lián)素及其受體基因敲除小鼠模型，觀察生理量脂聯(lián)素對(duì)其血管舒張功能的影響，以明確生理量APN對(duì)血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)作用。（2）應(yīng)用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）觀察脂聯(lián)素如何通過(guò)脂聯(lián)素受體影響內(nèi)皮功能。（3）探討脂聯(lián)素對(duì)其受體后信號(hào)NO生成及內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）活性影響，進(jìn)而解釋脂聯(lián)素對(duì)血管張力影響的機(jī)理。因而，本實(shí)驗(yàn)的研究目的為：
　　1、明確APN對(duì)小鼠血管內(nèi)皮功能的改善效應(yīng)和對(duì)NO產(chǎn)生的影響；
　　2、探索

5、APN對(duì)HUVEC中eNOS的影響，進(jìn)而揭示脂聯(lián)素I型和II型受體在eNOS活性調(diào)節(jié)中的作用；
　　3、探討Caveolin-1是否參與脂聯(lián)素受體誘導(dǎo)eNOS磷酸化過(guò)程，從而改善主動(dòng)脈內(nèi)皮功能。
　　方法：
　　1、選用6-8周齡正常C57BL野生型小鼠（WT），AdipoR1基因敲除小鼠（Adipo-R1KO），AdipoR2基因敲除小鼠（AdipoR2KO），Cav-1基因敲除小鼠（Cav-1KO），取其主動(dòng)脈，以

6、生理量脂聯(lián)素（5μg/ml）孵育15 min，觀測(cè)脂聯(lián)素對(duì)內(nèi)皮舒張功能， NO生成的影響；
　　2、原代培養(yǎng)HUVEC，并將培養(yǎng)的HUVEC分為5組：（1）對(duì)照組；（2）脂聯(lián)素組:脂聯(lián)素（終濃度為0，5，10和15μg/ml）作用0，15，30和60min；（3）脂聯(lián)素+AdipoR1 siRNA組:AdipoR1siRNA終濃度50nM，5μg/ml脂聯(lián)素作用15min；（4）脂聯(lián)素+AdipoR2 siRNA組： AdipoR

7、2 siRNA終濃度50nM，5μg/ml脂聯(lián)素作用15min；（5）脂聯(lián)素+Cav-1 siRNA組:Cav-1 siRNA終濃度50nM，5μg/ml脂聯(lián)素作用15min；
　　3、Western Blot技術(shù)測(cè)定各組HUVEC中eNOS和p-eNOS的蛋白表達(dá)量；
　　4、應(yīng)用基因沉默技術(shù)分別將HUVECs中AdipoR1、AdipoR2及Cav-1基因沉默；
　　5、提取50μl細(xì)胞上清直接上NO檢測(cè)儀，以Na

8、NO2為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)總NOx含量。
　　結(jié)果：
　　1、生理量脂聯(lián)素能增加小鼠血管的內(nèi)皮依賴性舒張效應(yīng)，顯著改善血管內(nèi)皮功能并且這種效應(yīng)依賴于NO；
　　2、脂聯(lián)素處理AdipoR1基因敲除小鼠，主動(dòng)脈對(duì)ACh的舒張反應(yīng)顯著降低，脂聯(lián)素處理AdipoR2基因敲除小鼠，主動(dòng)脈對(duì)ACh的舒張反應(yīng)無(wú)明顯影響；
　　3、脂聯(lián)素對(duì)Cav-1KO小鼠的血管舒張反應(yīng)降低；
　　4、不同濃度及時(shí)間脂聯(lián)素

9、對(duì)HUVECs一氧化氮合酶磷酸化（p-eNOS）的影響，5μg/ml脂聯(lián)素干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞，eNOS磷酸化程度在15min時(shí)表達(dá)最高，NO生成水平也最高；
　　5、siRNA抑制AdipoR1的表達(dá)后，與AdipoR1未抑制組相比，脂聯(lián)素(5μg/ml)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的磷酸化水平程度明顯降低，然而， AdipoR2 KD后，與AdipoR2未沉默組相比，脂聯(lián)素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的磷酸化程度無(wú)明顯變化；
　　6、 Caveo

10、lin-1 KD，顯著阻斷了脂聯(lián)素（5μg/ml）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的磷酸化和NO的產(chǎn)生。
　　結(jié)論:
　　1、生理量APN通過(guò)增加NO的產(chǎn)生從而對(duì)小鼠血管內(nèi)皮功能具有改善效應(yīng)；
　　2、APN通過(guò)脂聯(lián)素I型受體增加eNOS的磷酸化水平及NO的分泌，而II型受體對(duì)脂聯(lián)素誘導(dǎo)eNOS及NO生成影響不顯著。在內(nèi)皮細(xì)胞，I型II型受體在對(duì)脂聯(lián)素誘導(dǎo)的eNOS表達(dá)及活性調(diào)節(jié)中體現(xiàn)明顯的差異性；
　　3、Caveoli