實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)長鏈非編碼RNAs的篩選、功能研究及黃芪總皂苷的干預(yù)作用.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性、自身免疫性疾病，以慢性炎癥、滑膜細(xì)胞異常增生、關(guān)節(jié)腫脹與壓痛為其臨床特征，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受限、工作能力喪失，給患者和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。RA好發(fā)于35~50歲人群，女性發(fā)病率約為男性2~3倍。目前，RA具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為可能與免疫因素、環(huán)境因素、遺傳等有關(guān)。因此，積極探索RA的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在診斷標(biāo)志物具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。
　　以前關(guān)于RA

2、機(jī)制的研究主要集中在編碼基因。近年來，越來越多的研究表明長期以來被視為“噪音”和“暗物質(zhì)”的非編碼RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs），具有復(fù)雜的生物學(xué)功能。ncRNAs中的長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，LncRNAs）是由基因組中非編碼序列轉(zhuǎn)錄生成的、長度大于200nt、不具有翻譯成蛋白質(zhì)能力的轉(zhuǎn)錄本，在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、蛋白修飾過程中均可發(fā)揮重要的調(diào)控作用，與多種疾

3、病密切相關(guān)。但目前對RA發(fā)生、發(fā)展過程中 LncRNAs的調(diào)控作用仍知之甚少。
　　目前，西醫(yī)臨床上對于RA的治療，主要以減輕疼痛、控制癥狀為主，長期應(yīng)用副反應(yīng)明顯，患者多不能耐受或依從性差，遠(yuǎn)程療效不理想。因此，從傳統(tǒng)中藥中開發(fā)治療 RA的藥物，越來越受到重視。黃芪為豆科植物蒙古黃芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongolicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astraga

4、lus membranaceus（Fisch.） Bge.的干燥根，具有行滯通痹、補(bǔ)氣升陽、利水消腫等功效，為中醫(yī)臨床實(shí)踐中常用藥材。黃芪總皂苷（Astragalosides，AST）是黃芪的有效部位群，主要含有黃芪皂苷I~VIII等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，AST具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等多種藥理作用。
　　本課題擬在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，開展如下研究：（1）實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)長鏈非編碼RNAs的篩選及黃芪總皂苷的干預(yù)作用

5、；（2）基于LncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中關(guān)鍵 LncRNAs；（3） LncRNA S56464.1靶向miR-152/Wnt通路誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）增殖及黃芪總皂苷干預(yù)作用等研究，以期系統(tǒng)、深入地揭示LncRNAs在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色及黃芪總皂苷的干預(yù)作用，從 LncRNAs的角度揭示實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理，

6、并闡明黃芪總皂苷治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。
　　第一部分：實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)長鏈非編碼RNA的篩選及黃芪總皂苷的干預(yù)作用
　　目的：篩選實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中差異表達(dá)的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, LncRNAs)，探討實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎可能的發(fā)病機(jī)制及黃芪總皂苷可能的作用靶點(diǎn)。
　　方法：采用大鼠LncRNA基因芯片檢測佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠滑膜組織中

7、LncRNAs/mRNAs表達(dá)情況，以Fold change值>1.5，P-value<0.05篩選差異表達(dá)基因，進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）和信號(hào)通路（Pathway）分析，構(gòu)建差異表達(dá)基因LncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選關(guān)鍵差異LncRNAs并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對其進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：正常組和模型組共篩選出260個(gè)差異表達(dá)的 LncRNAs，其中模型組中上調(diào)LncRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)170個(gè)

8、，下調(diào)LncRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)90個(gè)；獲得675個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，模型組中上調(diào)mRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)422個(gè)，下調(diào)mRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)253個(gè)；共獲得4163個(gè)GO條目，其中上調(diào)差異基因富集于2494個(gè)GO條目，下調(diào)差異基因富集于1669個(gè)GO條目；獲得42條與差異基因相關(guān)的信號(hào)通路，其中上調(diào)差異基因富集于25條信號(hào)通路，下調(diào)差異基因富集于17條信號(hào)通路；6個(gè)關(guān)鍵LncRNAs（XR_008357, U75927, MRAK0462

9、51, XR_006457, DQ266363和 MRAK003448）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相一致。
　　正常組、模型組和AST組共篩選出75個(gè)差異表達(dá)的LncRNAs，與正常組和AST組相比，模型組上調(diào)LncRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)41個(gè)，下調(diào)LncRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)34個(gè)；篩選出247個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，模型組中上調(diào)mRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)171個(gè)，下調(diào)mRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)76個(gè)；共獲得135個(gè)GO條目，其中上

10、調(diào)差異基因富集于117個(gè)GO條目，下調(diào)差異基因富集于18個(gè)GO條目；共獲得17條與差異基因相關(guān)的信號(hào)通路，其中上調(diào)差異基因富集于14條信號(hào)通路，下調(diào)差異基因富集于3條信號(hào)通路；4個(gè)關(guān)鍵LncRNAs(MRAK012530、MRAK132628、MRAK003448、XR_00645）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相一致。
　　結(jié)論：LncRNAs在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中存在差異表達(dá)，AST防治實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與調(diào)

11、控差異表達(dá)的LncRNAs有關(guān)。
　　第二部分：基于LncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選實(shí)驗(yàn)性發(fā)病過程中關(guān)鍵LncRNAs
　　目的：篩選實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中關(guān)鍵LncRNAs，探討其可能的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：miRNAs基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于美國國立生物信息中心高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻(xiàn)，LncRNAs/mRNAs基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于課題組前期已發(fā)表文章；以差異倍數(shù)>2和 P-value<0.05

12、為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)的LncRNAs、miRNAs和mRNAs；借助miranda和 targetscan預(yù)測差異miRNAs靶向的mRNAs，借助RNAhybrid預(yù)測差異miRNAs靶向的LncRNAs；將miRNAs靶向的LncRNAs和mRNAs，分別與差異LncRNAs和mRNAs合并，取交集，得到共表達(dá)LncRNAs和mRNAs；以共表達(dá)LncRNAs、mRNAs和差異miRNAs為基礎(chǔ)，構(gòu)建LncRNA-miRNA-mRN

13、A共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行功能信息學(xué)分析，篩選實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中關(guān)鍵LncRNAs。
　　結(jié)果：LncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)由7個(gè)LncRNAs節(jié)點(diǎn)，24個(gè)miRNAs節(jié)點(diǎn)，90個(gè)mRNAs節(jié)點(diǎn)，301個(gè)邊緣組成；功能信息學(xué)分析結(jié)果表明，差異基因主要富集于147個(gè)GO條目，23條信號(hào)通路；LncRNA S56464.1, LncRNA XR_006437.1和LncRNA J01878被鑒定為實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的

14、關(guān)鍵基因。
　　結(jié)論：LncRNAs在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，LncRNA S56464.1, LncRNA XR_006437.1和LncRNA J01878可作為其潛在的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
　　第三部分：LncRNA S56464.1靶向miR-152/Wnt通路誘導(dǎo)FLS增殖及黃芪總皂苷干預(yù)作用
　　目的：明確LncRNA S56464.1通過靶向miR-152/Wnt通路誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞的

15、增殖作用，探討黃芪總皂苷治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。
　　方法：組織塊移植法分離、培養(yǎng)AA大鼠滑膜細(xì)胞，給予LncRNA S56464.1 siRNA和/或黃芪總皂苷干預(yù)，MTT法檢測成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocyte, FLS）的增殖反應(yīng)；RT-qPCR技術(shù)檢測 LncRNA S56464.1干擾和/或 AST作用下 LncRNA S56464.1、miR-152、β-連環(huán)蛋白（β-cate

16、nin）、原癌基因C-myc、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin） D1、糖原合成激酶（GSK）-3β和分泌型卷曲相關(guān)蛋白（SFRP）4 mRNA表達(dá)變化；免疫熒光和Western Blot技術(shù)檢測β-catenin、C-myc、Cyclin D1、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)和SFRP4蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：與模型組相比，LncRNA S6464.1干擾組和/或黃芪總皂苷組，不僅可明顯抑制AA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖

17、反應(yīng)，還可顯著降低LncRNA56464.1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1 mRNA，明顯抑制β-catenin、C-myc、Cyclin D1和p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β蛋白表達(dá)水平，升高miR-152和SFRP4 mRNA和/或蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：黃芪總皂苷對實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用，其機(jī)制可能與下調(diào) LncRNA S56464.1表達(dá)，調(diào)控miR-152/Wnt信號(hào)通路，抑制