可顯著提高下肢缺血性疾病干細胞移植效率的新型細胞移植體系研究.pdf

1、下肢缺血性疾病是老年人的常見疾病，也是世界上致殘率最高的疾病之一。目前的治療方法主要包括傳統(tǒng)的藥物治療和動脈旁路術，療效仍不理想。近幾年，干細胞移植作為一個新興的治療手段開始應用于下肢缺血性疾病的治療。它使用可分化，可自我更新的干細胞來代替死亡的肌肉細胞。干細胞治療的療效直接取決于注射后滯留在肌肉中的細胞的數(shù)量和存活率。但國內(nèi)外研究表明移植干細胞在肌肉中的滯留率和存活率極低，造成干細胞治療依然集中在動物實驗和臨床試驗階段，難以在臨床上應

2、用。所以提高移植干細胞滯留率和生存率是目前干細胞移植治療領域亟需解決的科學問題。移植干細胞的載體是影響干細胞滯留率的一個主要因素，目前國內(nèi)外尚無理想的應用于干細胞移植的專用載體，因此亟需創(chuàng)建一種新型高效的細胞載體。移植干細胞的生存率低是影響干細胞移植臨床應用的又一個主要因素。缺血肢體處于一個低氧、低營養(yǎng)的狀態(tài)，移植細胞極易死亡，故而造成移植細胞的大量喪失，因此要真正實現(xiàn)下肢缺血性疾病干細胞治療的臨床應用，就需要創(chuàng)造出可大幅提高干細胞存活

3、率的微環(huán)境，但目前國內(nèi)外仍無有效解決該問題的文獻報道。
　　目的：擬制備出溫敏、pH敏感且機械性能適宜的水凝膠作為干細胞移植的載體，提高移植干細胞的滯留率，將氧氣釋放微球引入該載體，以期達到提高移植干細胞及周圍的肌肉細胞在缺血、缺氧環(huán)境下的存活率，從而促進肌細胞再生，且盡量多的保留原有的肌細胞，并觀察這種新型的干細胞移植體系的治療效果；利用本課題組制備的新型水凝膠作為干細胞移植的載體，提高移植干細胞的滯留率，將 bFGF引入該載體

4、，以期促進一部分移植干細胞向血管內(nèi)皮細胞分化，進而促進缺血肢體盡早到達血運重建，改善肢體缺血狀態(tài)，提高肌肉功能，并觀察該體系對小鼠下肢缺血的治療效果。探討新的移植體系可干預的影響移植干細胞功能的其他靶點，為進一步改善干細胞移植體系提供思路。
　　方法：制備出水凝膠，建立新型細胞移植體系，并利用 dsDNA濃度測定、活細胞熒光成像、免疫熒光染色、實時聚合酶鏈反應等方法體外驗證該體系對干細胞生存及分化的影響；建立小鼠下肢缺血模型，利用

5、活細胞熒光成像、免疫熒光染色、實時聚合酶鏈式反應、蛋白印跡法、蘇木精-伊紅染色、梅森三色染色、多普勒血流檢測、跑步測試等方法體內(nèi)驗證該體系對干細胞在小鼠體內(nèi)的存活分化的影響，以及該體系對小鼠缺血下肢血運重建及恢復肌肉功能的效果。用成管實驗、細胞粘附實驗、細胞遷移實驗、蛋白印跡法探討肢體缺血狀態(tài)影響干細胞功能的機制。
　　結(jié)果：引入氧氣釋放微球的干細胞移植體系，體外檢測， dsDNA濃度測定隨時間增加而增高，且明顯高于陰性對照組（P

6、<0.05），與活細胞熒光成像結(jié)果一致，證實新的移植體系能大大提高干細胞的生存率；免疫熒光染色、實時聚合酶鏈反應也證實 ORM組干細胞向肌肉細胞及血管內(nèi)皮細胞方向分化更多；在小鼠下肢缺血模型中，活細胞熒光成像也證實此移植體系能大大提高干細胞的生存率；免疫熒光染色證實ORM組干細胞向肌肉細胞及血管內(nèi)皮細胞方向分化更多；蘇木精-伊紅染色、梅森三色染色、多普勒血流檢測、跑步測試等方法證實此體系有效的改善了缺血肢體肌肉萎縮情況，有助于肌肉功能的

7、恢復。引入bFGF的干細胞移植體系，體外檢測，dsDNA濃度測定隨時間增加而增高，且明顯高于陰性對照組（P<0.05），與活細胞熒光成像結(jié)果一致，證實此移植體系也能提高干細胞的生存率；免疫熒光染色、實時聚合酶鏈反應也證實bFGF組干細胞向肌肉細胞及血管內(nèi)皮細胞方向分化更多；在小鼠下肢缺血模型中，活細胞熒光成像也證實此移植體系能大大提高干細胞的生存率；免疫熒光染色、蛋白印跡法證實bFGF組干細胞向肌肉細胞及血管內(nèi)皮細胞方向分化更多；蘇木精

8、-伊紅染色、梅森三色染色、多普勒血流檢測也證實此體系有效的促進缺血肢體盡快血運重建，極大改善肌肉萎縮情況。成管實驗、細胞粘附實驗、細胞遷移實驗證實PA對EPCs功能有明顯抑制作用；蛋白印跡法證實PA誘導的神經(jīng)酰胺對EPCs的抑制作用是通過Akt/eNOS信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)的。
　　結(jié)論：新建立的干細胞移植體系能大大提高干細胞的滯留率和生存率，并能有效的分化成所需細胞系，改進干細胞治療下肢缺血性疾病的效果。進一步的機制探討為改進此新型