基于納米粒子探針的光學(xué)成像新方法研究.pdf

1、生命科學(xué)的迅速發(fā)展要求人們從單細(xì)胞和單分子水平上原位、活體、實(shí)時(shí)地了解物質(zhì)之間的相互作用以及生命的過(guò)程。近年來(lái)新興的單分子光學(xué)成像技術(shù)以其高的靈敏度和分辨率正好適應(yīng)這一發(fā)展的要求，而且它們自誕生以來(lái)就一直處于迅速的發(fā)展中，成為當(dāng)今生命科學(xué)及相關(guān)學(xué)科研究的前沿和熱點(diǎn)。與此同時(shí)，這些基于光學(xué)手段的生物成像技術(shù)除了光學(xué)構(gòu)型的革新和改進(jìn)之外在很大程度上還依賴于靈敏而穩(wěn)定的光學(xué)探針的使用。理想的光學(xué)探針應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)；穩(wěn)定，不易發(fā)生光漂

2、白；體積小，對(duì)標(biāo)記的宿主分子影響?。荒軌蚺c宿主分子可控結(jié)合；化學(xué)惰性。遺憾的是，至今沒(méi)有任何一種光學(xué)探針達(dá)到理想探針的要求。本研究從光學(xué)探針和光學(xué)成像方法兩方面入手，通過(guò)選擇并優(yōu)化合適的納米粒子以及改進(jìn)現(xiàn)有的光學(xué)成像技術(shù)，發(fā)展基于納米粒子探針的光學(xué)成像新方法以實(shí)現(xiàn)高靈敏、穩(wěn)定、快速的生物成像。主要研究?jī)?nèi)容如下： ⑴利用全內(nèi)反射熒光成像技術(shù)分別對(duì)水相合成的CdTe量子點(diǎn)和有機(jī)相合成的CdSe/ZnS量子點(diǎn)進(jìn)行了熒光成像，并且通過(guò)對(duì)

3、其熒光強(qiáng)度的跟蹤獲得了量子點(diǎn)在單粒子尺度上的熒光發(fā)射軌跡。我們發(fā)現(xiàn)在巰基丙酸、谷胱甘肽等含巰基配體的水溶液中合成的CdTe量子點(diǎn)不存在有機(jī)相合成量子點(diǎn)的熒光閃爍現(xiàn)象。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)巰基配體對(duì)量子點(diǎn)閃爍的抑制起到了至關(guān)重要的作用。最后，我們使用水相合成的CdTe量子點(diǎn)作為熒光探針成功地用于癌細(xì)胞的靶向成像。這些研究結(jié)果表明水相合成的CdTe量子點(diǎn)由于具有良好的水溶性，高亮度及不閃爍的特征可作為較好的熒光探針用于單分子檢測(cè)及生物成像領(lǐng)域。

4、 ⑵分別使用系綜熒光光譜、熒光相關(guān)光譜、熒光顯微鏡等不同的光學(xué)技術(shù)研究了粒徑范圍在16～55 nm的金納米粒子的光學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該粒徑范圍的金納米粒子具有一定的熒光。而且，隨著粒徑的增加，金納米粒子的熒光發(fā)射波長(zhǎng)幾乎保持不變，約為610 nm，其發(fā)射峰的半峰寬約為17 nm。盡管這些金納米粒子的熒光量子產(chǎn)率很低，但在較高激發(fā)強(qiáng)度下它們具有足夠強(qiáng)的熒光亮度可在單粒子尺度上被熒光顯微鏡和熒光相關(guān)光譜儀器所檢測(cè)。尤其重要的是，在強(qiáng)光照射

5、下，金納米粒子不漂白?；诮鸺{米粒子的抗漂白性質(zhì)以及細(xì)胞自熒光易漂白的特點(diǎn)，我們發(fā)展了一種以金納米粒子作為熒光探針的細(xì)胞成像新方法。該方法的主要原理是活細(xì)胞經(jīng)金納米粒子培育或特異性標(biāo)記后，利用光照將細(xì)胞自熒光迅速漂白，然后觀察細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞膜上的金納米粒子?；谏鲜鲈?，我們使用金納米粒子作為探針或者靶向探針成功實(shí)現(xiàn)HeLa癌細(xì)胞的熒光成像。而且，利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡甚至不需要經(jīng)過(guò)光漂白步驟就能夠?qū)崿F(xiàn)以金納米粒子作為熒光探針的細(xì)胞膜成

6、像。 ⑶金納米粒子在光照下由于表面等離子體共振效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的散射信號(hào)，然而目前使用金納米粒子作為散射光探針的生物成像方法主要局限于暗場(chǎng)顯微鏡、視頻增強(qiáng)微分干涉相襯顯微鏡等傳統(tǒng)光學(xué)成像技術(shù)。本文基于全內(nèi)反射熒光顯微鏡平臺(tái)，設(shè)計(jì)了一套物鏡型隱失波散射成像系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)使用一系列自制毫米級(jí)小孔對(duì)金納米粒子的散射光和激光的反射光束進(jìn)行有效分離，實(shí)現(xiàn)單個(gè)金納米粒子的隱失波散射檢測(cè)及溶液中單個(gè)金納米粒子的快速跟蹤。在本章中，我們?cè)敿?xì)闡述

7、了物鏡型隱失波散射成像的實(shí)現(xiàn)原理以及研究了激光入射角、小孔孔徑和視場(chǎng)光闌開口直徑等參數(shù)對(duì)該系統(tǒng)散射成像的影響。結(jié)果表明：通過(guò)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)激光光束的入射角，小孔可應(yīng)用的孔徑范圍位于2.5 mm到4 mm之間。最后，我們使用該隱失波散射成像技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞膜上單個(gè)金納米粒子的跟蹤，并且進(jìn)一步研究了單個(gè)金納米粒子在活細(xì)胞膜上的擴(kuò)散行為并計(jì)算其相應(yīng)的擴(kuò)散系數(shù)。我們的研究結(jié)果表明以金納米粒子作為光學(xué)探針的隱失波散射成像技術(shù)是一種非常具有前途的用