抗阿爾茲海默病Stemazole衍生物的篩選及其改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用研究.pdf

1、背景:
　　阿爾茲海默病(AD)足一種以學(xué)習(xí)記憶功能障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病。目前用于治療AD的方法主要為藥物治療，如膽堿酯酶抑制劑和抗氧化劑等。近來研究發(fā)現(xiàn)，新型小分子化合物Stemazole具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用，且對阿爾茲海默病大鼠有一定治療效果。經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)改造，獲得一系列Stemazole衍生物。本文就Stemazole衍生物進(jìn)行了藥效篩選，篩選可明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的候選化合物，并對該化合物進(jìn)行藥理性質(zhì)和體

2、內(nèi)作用研究，為阿爾茲海默病的新藥開發(fā)提供新的方向。
　　目的:
　　1.提取和鑒定大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞。
　　2.篩選可明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的化合物，并探索藥物的作用機(jī)制。
　　3.考察藥物的抗氧化和膽堿酯酶抑制能力及對肝細(xì)胞的毒性。
　　4.建立D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型，通過測量小鼠逃避潛伏期、原平臺穿越次數(shù)、原平臺所在區(qū)域游泳時間和路程，研究小鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變。
　　5.考察D-半

3、乳糖致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠肝臟、海馬和紋狀體組織的萎縮衰老情況，并測量上述組織中的SOD水平和MDA含量，研究藥物對機(jī)體的抗衰老作用。
　　方法:
　　1.體外提取培養(yǎng)SD大鼠海馬區(qū)的細(xì)胞，用細(xì)胞免疫熒光法鑒定原代培養(yǎng)神經(jīng)干。傳代細(xì)胞經(jīng)血清誘導(dǎo)分化后，用細(xì)胞免疫熒光法鑒定分化細(xì)胞。
　　2.采用ATP法研究并篩選Stemazole衍生物，觀察候選化合物不同濃度和時間作用后神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)和增殖情況。
　　3.用ABTS

4、法檢測目標(biāo)化合物的總抗氧化能力，Ellman法測定化合物對乙酰膽堿酯酶抑制IC50值，ATP法研究化合物對小鼠正常肝細(xì)胞的毒性。
　　4.每日頸部皮下注射D-半乳糖，建立小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行行為學(xué)分析。
　　5.實(shí)驗(yàn)小鼠采血后處死，分離并稱量肝臟、海馬和紋狀體組織，檢測血清、海馬和紋狀體組織中的SOD水平和MDA含量。
　　結(jié)果:
　　1.體外提取的海馬區(qū)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫熒

5、光染色鑒定呈Nestin陽性，用血清誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞免疫熒光染色鑒定呈GFAP陽性和Tubulin陽性，證明原代提取的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞，且具有分化能力。
　　2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物DM-4促神經(jīng)干細(xì)胞增殖效果最明顯。同一時間該化合物對神經(jīng)干細(xì)胞的促增殖作用與藥物濃度大致呈“倒U”型關(guān)系，最大有效濃度為10 mM。作用時間延長，藥物促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的效果越明顯，顯微鏡下可觀察到神經(jīng)干細(xì)胞球半徑增大，且數(shù)目增多。
　　

6、3.總抗氧化能力檢測結(jié)果顯示，化合物DM-4的抗氧化能力是對照藥水溶性維生素E(Trolox)的1.186倍，具有抗氧化活性;Ellman法檢測乙酰膽堿酯酶抑制結(jié)果顯示，與乙酰膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊相比，化合物DM-4對乙酰膽堿酯酶抑制效果很弱(IC50=1410.667μ M)。藥物體外作用正常肝細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，隨濃度增加，肝細(xì)胞生長抑制率上升緩慢，當(dāng)濃度達(dá)到1000μ M時，抑制率小于50％，顯示低毒性。
　　4.Morri

7、s水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，DM-4給藥組小鼠的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加明顯縮短(P＜0.01)。訓(xùn)練結(jié)束后，撤去平臺，DM-4給藥組小鼠穿越原平臺次數(shù)、在第三象限游泳時間和游泳路程較模型組均增加(P＜0.05)。
　　5.小鼠各臟器重量指數(shù)表明，與模型組相比，DM-4給藥組小鼠肝臟、海馬和紋狀體重量指數(shù)均上升。血清、海馬和紋狀體組織的SOD水平和MDA含量檢測發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，DM-4給藥組小鼠上述組織的SOD水平均明

8、顯上升(P＜0.01)，MDA含量均下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　Stemazole衍生物DM-4具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和抗氧化雙重藥理活性。體外促神經(jīng)干細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，該化合物促增殖作用存在最大有效濃度，且隨著作用時間增長，效果越明顯。同時小鼠正常肝細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，該化合物具有低毒性的優(yōu)點(diǎn)。D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型也表明，化合物DM-4可改善疾病小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并能清除體內(nèi)氧自由基以抵抗衰老。因